trừu tượng
Trong nhiều thế kỷ, nhung hươu (VA) đã được phổ biến như một phương thuốc để điều trị các bệnh khác nhau ở một số nền văn hóa châu Á. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nghiên cứu ảnh hưởng của chiết xuất VA trong nước đối với sự tăng sinh của tế bào T của người thành một siêu kháng nguyên, staphylococcal enterotoxin B (SEB) trong ống nghiệm. Tế bào đơn nhân máu ngoại vi đánh dấu CFSE từ những người hiến tặng khỏe mạnh được ủ với SEB với sự hiện diện của dịch chiết, và sự tăng sinh của chúng được phân tích bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy 72 giờ sau đó. VA làm tăng sự phát triển của cả tế bào T CD4 + và CD8 + thành SEB theo cách phụ thuộc vào liều lượng, nhưng không gây phân bào khi không có SEB trong khoảng nồng độ đã nghiên cứu (1–500 µg / mL). Sự bất hoạt nhiệt không ảnh hưởng đến hoạt động đồng kích thích. Hoạt động này rõ ràng hơn ở những người có phản ứng yếu hơn với SEB.
Giới thiệu
VA đã được sử dụng ở Trung Quốc, Nga, Hàn Quốc và các quốc gia khác trong hơn 10 thế kỷ như một “chất thích nghi” giúp phục hồi sau nhiều bệnh tật, bao gồm chấn thương, căng thẳng sau phẫu thuật, bệnh truyền nhiễm và mệt mỏi. 1 Là các cơ quan phát triển rất nhanh (lên đến 2,75 cm mỗi ngày), 2gạc hươu được coi là có tác dụng thúc đẩy và đóng vai trò là nguồn cung cấp các yếu tố trung gian cho quá trình tái tạo mô; tuy nhiên, bản chất của các yếu tố gây ra các tác dụng y học được nêu trong nó vẫn chưa rõ ràng. Gần đây, mối quan tâm ngày càng tăng đối với thuốc “tự nhiên” hoặc thuốc bổ sung đã khuyến khích nghiên cứu về bản thân gạc, dẫn đến việc chứng minh một số yếu tố tăng trưởng được biểu hiện trong gạc đang phát triển, chẳng hạn như yếu tố tăng trưởng giống insulin (IGF) -1 và -2, chuyển đổi tăng trưởng yếu tố b (TFGb), yếu tố tăng trưởng biểu bì, protein hình thái xương-4, neurotrophin-3, yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi-2, yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu và yếu tố tăng trưởng thần kinh. 3–8 Những yếu tố này có thể chịu trách nhiệm về tác dụng tái tạo của các chế phẩm nhung được quan sát thấy trên mô hình động vật hoặc trong ống nghiệm, 9–11và một số người trong số họ là những người chơi được biết đến trong các phản ứng miễn dịch. 12–14 Tuy nhiên, tác động của VA đối với tình trạng viêm và phản ứng miễn dịch, mặc dù thường xuyên được các bác sĩ tuyên bố, nhưng rất khó để chứng minh trực tiếp và có một tài liệu hạn chế đề cập đến vai trò của VA trong miễn dịch. 15
Các phản ứng miễn dịch rất phức tạp và liên quan đến việc nhận biết chung các “tín hiệu nguy hiểm” và các phản ứng có chọn lọc đối với các mục tiêu cụ thể, kháng nguyên. Chức năng đầu tiên nói chung là chức năng của hệ thống miễn dịch bẩm sinh (đại thực bào), trong khi chức năng thứ hai là trách nhiệm của hệ thống miễn dịch thích ứng (tế bào lympho T và B). Nếu phản ứng miễn dịch quá yếu, cơ thể không thể xóa mục tiêu (thường là mầm bệnh); nếu nó quá mạnh, các tế bào miễn dịch có thể gây hại cho các tế bào và mô của cơ thể do bị viêm quá mức. Thông thường, hệ thống miễn dịch có khả năng tự điều chỉnh, và nếu không làm như vậy sẽ dẫn đến các bệnh viêm nhiễm, nhiễm trùng mãn tính hoặc tự miễn nghiêm trọng, do đó tầm quan trọng của việc tìm kiếm các loại thuốc có khả năng làm giảm hoặc tăng cường phản ứng miễn dịch. Dược điển phương Tây có một số loại thuốc mạnh có tác dụng theo cả hai hướng, chẳng hạn như thuốc ức chế miễn dịch không đặc hiệu (ví dụ, corticosteroid, cyclosporin, tacrolimus), thuốc kích thích miễn dịch (ví dụ, interferon, các cytokine khác), và các thuốc chẹn cytokine hoặc thụ thể cytokine mới và chọn lọc hơn (ví dụ, infliximab, anakinra, daclizumab). Việc sử dụng lâm sàng các loại thuốc như vậy thường đi kèm với các tác dụng phụ rõ rệt, một số có thể nghiêm trọng (ví dụ, độc tính trên gan và thận, kích hoạt nhiễm trùng tiềm ẩn, sốt cao, phát ban, đau khớp). Điều này, cùng với giá thành cao của các loại thuốc này, hạn chế các chỉ định lâm sàng đối với các tình trạng nghiêm trọng nhất (ví dụ: đào thải allograft, nhiễm trùng kháng thuốc, sốc nhiễm trùng) và đòi hỏi phải tìm kiếm thêm các chất điều chỉnh đáp ứng miễn dịch an toàn hơn. Điều này dẫn nhiều nhà nghiên cứu đến lĩnh vực y học bổ sung và tập trung vào việc sử dụng lâm sàng trực tiếp các chế phẩm tự nhiên (có nguồn gốc thực vật và động vật). Nghiên cứu y học bổ sung có tiềm năng cho những khám phá về các thành phần phân tử hoạt động với các đặc tính điều trị mới và đã biết. Việc chứng minh trực tiếp các tác dụng dược lý của các hợp chất phức tạp, khi chúng được trình bày trong các công thức tự nhiên, trong các hệ thống sinh học xác định, chẳng hạn như nuôi cấy tế bào in vitro, có thể đóng vai trò là một liên kết quan trọng.
Chúng tôi quan tâm đến việc nghiên cứu ảnh hưởng của VA đối với phản ứng của tế bào T ở người với kháng nguyên. Ở đây, chúng tôi đã sử dụng chiết xuất dạng nước của gạc hươu Siberia được phân tán mịn trong hệ thống in vitro, trong đó các tế bào T bình thường của người phản ứng với độc tố ruột B (SEB) của tụ cầu. Chúng tôi đo sự tăng sinh tế bào T (sự mở rộng dòng vô tính) đáp ứng với SEB có và không có VA như một kết quả đo khả năng đáp ứng và báo cáo rằng VA làm tăng sự tăng sinh tế bào T theo cách phụ thuộc vào liều lượng.
Vật liệu và Phương pháp
Nuôi cấy tế bào và xét nghiệm tăng sinh
Tất cả các giao thức đã được phê duyệt bởi Hội đồng Đánh giá Thể chế của Đại học Yale. Máu người bình thường được làm giàu bạch cầu được lấy từ Cơ sở Phòng thí nghiệm Trung tâm, Trung tâm Máu New York (Thành phố Long Island, NY), và các tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC) được phân tách bằng gradient Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare, Uppsala, Thụy Điển) ly tâm. Chúng được dán nhãn CFSE bằng Bộ công cụ theo dõi tế bào (Invitrogen, Grand Island, NY) và được nuôi cấy trong môi trường AIM-V (Invitrogen), ở 1×106 / mL với SEB (1μg / ml, Sigma, St. Louis, MO) ở 37oC, trong môi trường có 5% CO2.
Chuẩn bị dịch chiết VA trong nước
Bột VA (quà tặng của Công ty SpectrAcoustics, Saratov, Liên bang Nga) đã được vô trùng bổ sung vào PBS (Invitrogen) vô trùng ở 1,5g / 30 mL, ủ 24 giờ ở 4oC, tiệt trùng bằng bộ lọc và được bảo quản trong tủ đông lạnh ở -20oC. Nồng độ protein được xác định bằng Bộ công cụ xét nghiệm protein BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL). Các phần mới rã đông được pha loãng lần lượt với môi trường AIM-V để thu được nồng độ cuối cùng là 1–500 µg / mL khi được thêm vào PBMC của người. Albumin huyết thanh bò (BSA) từ Sigma được sử dụng như một đối chứng âm tính. Trong các thí nghiệm riêng biệt, dịch chiết VA được ủ ở 56oC trong nồi cách thủy trong 30 phút trước khi sử dụng trong nuôi cấy tế bào. Ảnh hưởng của VA đến sự tăng sinh được tính bằng [1 – (% chia có thêm VA /% chia không có VA)] x100. Hàm lượng cytokine phản ứng miễn dịch được đo bằng bộ dụng cụ Milliplex (Millipore Corporation, Billerica,
Phân tích dữ liệu
Dữ liệu được biểu thị dưới dạng sai số chuẩn. Phân tích thống kê được thực hiện bằng phần mềm GraphPad Prizm © Phiên bản 5 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Một cách phân tích phương sai (ANOVA) đã được áp dụng để so sánh giữa các nhóm. Phân tích hồi quy tuyến tính được sử dụng để đánh giá mối tương quan.
Các kết quả
Ảnh hưởng của VA đến sự gia tăng PBMC thành SEB
SEB được nhận biết bởi một tỷ lệ lớn tế bào T, chúng mang các thụ thể tế bào T được tạo ra từ các chuỗi beta V cụ thể. Vì việc sử dụng các chuỗi V beta này khác nhau ở các cá thể khác nhau, tỷ lệ tế bào T phản ứng với siêu kháng nguyên cũng khác nhau. Trong nghiên cứu này, phần trăm trung bình của các tế bào đã phân chia vào cuối 72 giờ ủ là 66,8 ± 5,6 (khoảng 38,1–90,8%; n = 8). Bổ sung chiết xuất VA làm tăng sự phân chia tế bào phụ thuộc vào liều lượng. Hình 1A cho thấy một ví dụ về sự tăng sinh tế bào T được đo bằng sự pha loãng CFSE trong các tế bào con và sự gia tăng của nó ở nồng độ VA cao hơn. Không có sự gia tăng khi không có SEB, ngay cả ở nồng độ VA cao nhất được sử dụng (dữ liệu không được hiển thị). Hiệu ứng kích thích vũ trụ không phải do tác động không đặc hiệu của protein xenogeneic, vì việc bổ sung BSA ở cùng liều lượng không hiệu quả (Hình 1B). Tóm tắt 8 thí nghiệm riêng biệt cho thấy tác dụng kích thích vũ trụ của chiết xuất VA có ý nghĩa thống kê so với đối chứng không có VA ở nồng độ 100 và 500 μg / mL (Hình 1C). Hoạt động kích thích của chiết xuất chịu được nhiệt ở 56oC trong 30 phút, cho thấy nó không nằm trong nhóm protein bền nhiệt nhất, chẳng hạn như bổ thể (dữ liệu không được hiển thị).
Hình 1A
Hình 1B
Hình 1C
Hình 1
Ảnh hưởng của chiết xuất VA trong nước lên sự tăng sinh của tế bào lympho T ở người thành SEB.
(A) PBMC của người được đánh dấu CFSE và ủ với SEB với sự hiện diện của các nồng độ khác nhau của chiết xuất VA trong 72 giờ, sau đó sự tăng sinh được phân tích bằng phương pháp đo tế bào dòng (một thí nghiệm cá nhân đại diện cho thấy% tế bào được phân chia dưới dạng đỉnh con). Không có sự phân chia tế bào nào khi không có SEB. (B) Kết quả của một thử nghiệm cho thấy rằng việc kích thích tăng sinh bởi VA (bảng bên phải) so với chỉ SEB (bảng bên trái) không phải do sự hiện diện của protein xenogeneic, vì việc bổ sung BSA (bảng điều khiển trung tâm) không hiệu quả ngay cả ở nồng độ cao nhất. (C) Bản tóm tắt 8 thí nghiệm độc lập, mỗi thí nghiệm đại diện cho một nhà tài trợ PBMC riêng biệt, cho thấy% tăng sinh ở các nồng độ khác nhau của chiết xuất VA, như được mô tả trong Vật liệu và Phương pháp. * P <0,05 bởi ANOVA.
Chiết xuất VA kích thích sự tăng sinh của cả tế bào T CD4 + và CD8 +, nhưng không phải ung thư hạch tế bào T.
Để kiểm tra xem VA có ưu tiên kích thích tế bào T CD4 + hoặc CD8 + hay không, chúng tôi đánh dấu các quần thể con này bằng các kháng thể huỳnh quang và phân tích sự tăng sinh của chúng thành SEB bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy. Như thể hiện trên Hình 2A, cả tế bào T CD4 + và CD8 + đều đáp ứng với SEB, và đáp ứng của chúng được tăng cường nhờ chiết xuất VA theo cách phụ thuộc vào liều lượng với đỉnh ở 100 μg / mL.
Khả năng của chiết xuất VA trong việc tăng sinh tế bào T của người có thể gây ra mối lo ngại về an toàn, cụ thể là khả năng kích thích các khối u ác tính của tế bào T. Để kiểm tra điều đó, chúng tôi đã nuôi cấy tế bào Jurkat, là một dòng ung thư hạch tế bào T ở người, với nồng độ VA ngày càng tăng. Không quan sát thấy sự gia tăng tăng sinh của tế bào Jurkat, cho thấy rằng VA không phải là nguyên nhân gây ung thư hạch bạch huyết phân chia tự động (Hình 2B).
Vì hoạt động kích thích vũ trụ có thể do sự hiện diện của một số cytokine phản ứng chéo, chúng tôi đo các cytokine của người sau đây trong dịch chiết: IL-1b, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70 , IL-13, IL-17, IFNg và TNF; không có cytokine nào được liệt kê được phát hiện trong dịch chiết VA ở tổng nồng độ protein lên đến 1,6 mg / mL.
Hoạt động kích thích của chiết xuất VA tương quan nghịch với khả năng đáp ứng của tế bào T
Để kiểm tra xem liệu chiết xuất VA có kích thích phản ứng của tế bào T hay không bất kể mức độ phản ứng với siêu kháng nguyên, chúng tôi đã so sánh phần trăm tế bào được phân chia khi không có VA với phần trăm tăng sinh ở 100 μg / mL. Như thể hiện trên Hình 2C, một mối tương quan âm có ý nghĩa được tìm thấy ( P = 0,011; R 2 = 0,57), cho thấy rằng tác động của VA mạnh hơn ở những người phản ứng yếu hơn với SEB.
Hình 2A
Hình 2B
Hình 2C
Hình 2
Tác dụng của chiết xuất VA trong nước đối với sự tăng sinh của tế bào T ở người, tập hợp con tế bào T và ung thư hạch Jurkat.
(A) PBMC của người bình thường được đánh dấu CFSE và ủ với SEB với sự hiện diện của các nồng độ khác nhau của chiết xuất VA trong 72 giờ, sau đó được đánh dấu bằng các kháng thể kháng CD4 và kháng CD8. Sự tăng sinh được phân tích bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy. Dữ liệu được tổng hợp từ hai thử nghiệm riêng biệt cho kết quả tương tự (NS, ANOVA hai chiều). (B) Tế bào ung thư hạch Jurkat được ủ trong 96 giờ với các nồng độ VA khác nhau và% thay đổi tăng sinh được tính toán, như đã mô tả. (C) Phân tích hồi quy tuyến tính mối quan hệ giữa tổng số tế bào T tăng sinh với SEB và% đồng kích thích ở 100 μg / mL dịch chiết VA (P = 0,011; R2 = 0,57).
Thảo luận
Trong các thí nghiệm của mình, chúng tôi đã sử dụng chiết xuất VA trong nước lạnh để bảo tồn hoạt tính sinh học tiềm năng của protein và nhận thấy rằng, ở liều 100 μg / mL tổng hàm lượng protein, VA làm tăng sự phát triển tế bào T, đây là chỉ số chuẩn của khả năng đáp ứng miễn dịch, và cả tế bào T CD4 + và CD8 + đều tham gia; tuy nhiên chiết xuất không tạo ra sự tăng sinh khi không có kích thích kháng nguyên, cũng như không kích hoạt sự phân chia của một dòng tế bào ung thư hạch. Tổng hợp lại, những quan sát này cho thấy rằng các chế phẩm VA có thể thích hợp làm thực phẩm bổ sung để điều chỉnh miễn dịch. Điều thú vị là ở một nửa số người được thử nghiệm, tác dụng kích thích của VA ở 500 μg / mL thấp hơn ở 100 μg / mL, cho thấy rằng chế phẩm cũng chứa các yếu tố chống tăng sinh bắt đầu chiếm ưu thế ở nồng độ cao hơn của dịch chiết. Một cách giải thích khác có thể là do một số cá nhân nhất định phản ứng với (các) tín hiệu kích thích liều cao một cách nghịch lý. Các thí nghiệm bổ sung là cần thiết để giải quyết thêm câu hỏi này.
Dữ liệu của chúng tôi chỉ ra rằng, khi được kích hoạt với siêu kháng nguyên, các tế bào T của con người phản ứng bằng cách tăng sinh, được tăng lên theo cách phụ thuộc vào liều lượng bằng cách bổ sung chiết xuất VA dạng nước. Hoạt động kích thích vũ trụ này là 1) không phải do tác động không đặc hiệu của một protein được thêm vào, vì BSA không hiệu quả; 2) chịu được bất hoạt nhiệt ở 56oC, cho thấy rằng đó không phải là do bổ sung tuần hoàn của hươu; và 3) không phải do tác động phân bào trực tiếp không rõ nguồn gốc, vì không có sự tăng sinh mà không có SEB bất kể nồng độ VA.
Nội dung của VA rất phức tạp và vẫn chưa rõ yếu tố nào gây ra hiệu ứng kích thích mà chúng tôi báo cáo. Các cytokine tuần hoàn và liên kết nền, chẳng hạn như TGFb, TNF, IGF-1 và một số loại khác có thể cung cấp hoạt động này.16–19 Do đó, chúng tôi đã cố gắng phát hiện một số cytokine có hoạt tính miễn dịch bằng cách sử dụng thuốc thử cho các yếu tố của con người; mặc dù không có cytokine nào được thử nghiệm được phát hiện trong chiết xuất VA, chúng tôi không thể loại trừ rằng chúng có mặt và có thể góp phần kích thích vũ trụ, vì chúng tôi không có thông tin về phản ứng chéo của thuốc thử với cytokine của hươu.
Là một chất dẫn xuất từ da, nhung hươu có chứa melanin, sắc tố chính trong da, và chiết xuất từ nước vẫn giữ được màu nâu sẫm của nó.
Là một dẫn xuất của da, VA chứa melanin, sắc tố chính trong da, và chiết xuất từ nước giữ lại màu nâu sẫm của nó. Melanin đã được báo cáo là chất kích hoạt các phản ứng của tế bào T 20–21 và có thể quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của các bệnh tự miễn như viêm màng bồ đào và bệnh bạch biến. Một trong những cơ chế mà melanin có thể kích thích sự tăng sinh tế bào T là bằng cách dập tắt các loại oxy phản ứng 22 thường được tạo ra trong quá trình hoạt hóa tế bào lympho 23 và do đó làm giảm stress oxy hóa và quá trình apoptosis theo cách tương tự như tác dụng của polyphenol. 24
Một thành phần ứng cử viên khác có thể chịu trách nhiệm cho sự kích thích là phosphatidyl choline. Một báo cáo trước đó của Kim và cộng sự đã chỉ ra rằng phản ứng của tế bào lá lách chuột với lectin, Concanavalin A, có thể được tăng cường bởi phosphatidyl choline được phân lập từ VA .25 Điều thú vị là, tương tự như quan sát của chúng tôi, Kim và cộng sự nhận thấy phosphatidyl choline không phải là yếu tố kích thích trong sự vắng mặt của lectin.
Nghiên cứu của chúng tôi không nhằm mục đích phân tích thành phần VA nào là yếu tố đóng góp chính vào hiệu quả quan sát được. Chúng tôi chỉ sử dụng các chất chiết xuất từ nước và do đó có thể đã mất một số thành phần kỵ nước, chẳng hạn như vitamin và hormone hòa tan trong lipid trong quá trình chiết xuất, mặc dù chúng có thể được hòa tan bằng chất nhũ hóa tự nhiên và bằng cách liên kết với protein.
Chúng tôi đã phát hiện tác động kích thích của VA đối với sự tăng sinh tế bào T trong khoảng từ 10 đến 500 µg / mL. Không chắc rằng nồng độ như vậy có thể đạt được một cách hệ thống sau khi tiêu thụ 1–2 g bằng đường uống, hãy ghi nhớ sự tiêu hóa một phần các thành phần trong ruột; tuy nhiên, chúng tôi suy đoán rằng khi uống vào, VA có thể đi đến phần trên của ruột non với số lượng như vậy và nếu có, có thể đóng góp vào vai trò của hệ thống miễn dịch niêm mạc trong việc bảo vệ chống lại các mầm bệnh và phản ứng hệ thống mồi.
Tác động kích thích mạnh hơn ở những người phản ứng kém và yếu hơn ở những người phản ứng mạnh (Hình 2), điều này cho thấy rằng hoạt động của VA có thể được mô tả là điều tiết hơn là kích thích. Nếu những kết quả này có thể được mở rộng cho con người, những người có phản ứng miễn dịch thấp có thể đáp ứng tốt hơn với việc bổ sung VA hơn những người có phản ứng bình thường hoặc cao.
Phần kết luận
Dữ liệu của chúng tôi chỉ ra rằng VA có tác dụng kích thích sự tăng sinh tế bào T để đáp ứng với SEB siêu kháng nguyên trong ống nghiệm. Những kết quả này cung cấp bằng chứng hỗ trợ việc sử dụng VA truyền thống để tăng cường phản ứng miễn dịch; tuy nhiên, kết quả của chúng tôi yêu cầu xác minh in vivo bằng cách sử dụng các mô hình khác, chẳng hạn như chuột được nhân hóa và các thử nghiệm lâm sàng trực tiếp để nghiên cứu ảnh hưởng của VA đối với chức năng miễn dịch ở người.
Trang thân thiện với máy in
