Thuốc thử

Peptide MOG35-55 đông khô [MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK] được mua từ GenScript (Piscataway, NJ, USA) được hoàn nguyên trong PBS vô trùng và dung dịch gốc được bảo quản trong nồi cách thủy ở -20 ° C. CBD (vui lòng lấy từ Giáo sư Raphael Mechoulam, Đại học Hebrew của Jerusalem, Israel) được hòa tan trong ethanol. Liều 5 μM CBD được sử dụng ở đây được lựa chọn dựa trên các nghiên cứu trước đây của chúng tôi, trong đó chúng tôi cho thấy CBD ở nồng độ này ức chế đáng kể sự tăng sinh tế bào T _MOG do MOG35-55 gây ra và hoạt động Th17 của chúng, tức là sự biểu hiện và phóng thích IL-17 [ 12 , 24 , 26 ]. Huyết thanh bê thai (FCS) và các thuốc thử nuôi cấy mô khác được lấy từ Công nghiệp sinh học (Kibbutz Beit HaEmek, Israel).

Kích thích T _MOG và tinh sạch vi hạt CD4 ⁺ từ đồng nuôi cấy APC / T _MOG

Dòng tế bào T đặc hiệu MOG35-55 (T _MOG ) được duy trì như mô tả trước đây [ 12 , 24 , 26 , 28 ]. APC mới được phân lập từ lá lách của những con chuột đực C57BL / 6 mới 8 tuần tuổi ngay trước khi thí nghiệm. Tế bào lá lách phân ly được mạ (50 × 10 ⁶ tế bào / bản 10 cm) trong môi trường RPMI-1640 có chứa 2,5% FCS, 100 μg / ml streptomycin, 100 U / ml penicillin, 2 mM L-glutamine và 50 μM β-mercaptoethanol . Sau 2 giờ ở 37 ° C trong không khí được làm ẩm 5% CO2 để cho phép APC bám dính, môi trường có các tế bào không kết dính được loại bỏ và các APC kết dính được rửa nhẹ bằng PBS có chứa Ca ⁺⁺ / Mg ⁺⁺ và được phủ bằng môi trường mới. Sau đó, 2,5 × 10 ⁶tế bào T _MOG được thêm vào và đồng nuôi cấy APC / T _MOG được kích thích ngay lập tức với 5 μg / ml MOG35-55 trong 8 giờ khi có hoặc không có CBD ở 5 μM. Thời gian ủ 8 giờ được chọn dựa trên các thí nghiệm đáp ứng thời gian và liều lượng trước đó [ 24 , 26 , 29 ]. CBD đã được thêm vào ngay trước khi bổ sung MOG35-55. Sau 8 giờ ủ, môi trường chứa hầu hết các tế bào T _MOG (nhưng không phải tế bào APC kết dính) được thu thập cẩn thận và quay trong 10 phút ở tốc độ 2.000 vòng / phút. Viên tế bào được rửa trong PBS chứa 0,5% BSA và 2 mM EDTA, được ly tâm một lần nữa, và được tiếp tục trong 90 μl dung dịch đệm này. Để cải thiện độ tinh khiết của các tế bào được thu thập, các hạt từ tính CD4 (L3T4) (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Đức) được thêm vào huyền phù tế bào để chọn lọc dương tính các tế bào CD4 ⁺ như đã mô tả trước đó [ 26 , 29 ]. MRNA được phân lập từ các tế bào T _MOG tinh khiết được phân tích biểu hiện microarray mRNA toàn cầu, sau đó là phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược theo thời gian thực định lượng (qPCR) để xác nhận các sản phẩm gen đã chọn.

Tách chiết RNA, phân tích bản sao microarray và xác nhận bằng qPCR

Tế bào T _MOG tinh khiết đã được ly giải và được chiết tách RNA ( 5Prime , Darmstadt, Đức) như đã mô tả trước đó [ 26 , 29 , 30 ]. Đối với phân tích microarray so sánh, 200 ng RNA tổng số được khuếch đại, đánh dấu và lai ghép vào Illumina MouseRef-8 v 2.0 Expression Bead-Chip ( Illumina Inc. , San Diego, CA, USA) như đã mô tả trước đó [ 26 , 29]. Dữ liệu thô đã được chuyển đổi log2 và chuẩn hóa bằng cách sử dụng chuẩn hóa lượng tử. Dữ liệu được trình bày trong toàn bộ bản thảo dưới dạng thay đổi gấp trừ khi có quy định khác. Phân tích microarray thống kê và phân tích biểu hiện gen của dữ liệu thô được thực hiện tại Trung tâm Tin học về Di truyền thần kinh và lõi Neurogenomics tại UCLA bằng cách sử dụng tập lệnh R ( www.r-project.org ) và các gói Bioconductor ( http://www.bioconductor.org ; [ 31 ]) như được mô tả [ 32 ] .

Các phân tích về lộ trình và chức năng toàn cầu được thực hiện bằng Phân tích Lộ trình Tài năng của QIAGEN (IPA®, QIAGEN Redwood City CA, USA www.qiagen.com/ingenuity ). Các gen đáp ứng ngưỡng giá trị p là 0,005 cho biểu hiện khác biệt được sử dụng để xây dựng mạng lưới gen bằng các công cụ IPA.

Phân tích mạng đồng biểu hiện gen có trọng số (WGCNA; [ 33 ]) ( http://labs.genetics.ucla.edu/horvath/htdocs/CoexpressionNetwork/) đã được áp dụng để hoàn thành việc xác định đặc điểm chức năng của dữ liệu biểu hiện gen. WGCNA là một phương pháp phân tích công nhận các mạng đồng biểu hiện dựa trên sự chồng chéo cấu trúc liên kết giữa các gen và xem xét mối tương quan của hai gen với nhau và mức độ tương quan được chia sẻ của chúng trong mạng. Tóm lại, các gen hiện diện nhất quán trên các mảng có hệ số hiệp biến cao và kết nối cao đã được chọn để xây dựng mạng và được phân nhóm theo thứ bậc. Các cụm gen (mô-đun) có liên kết cao được xác định dựa trên sự chồng chéo cấu trúc liên kết của chúng bằng cách sử dụng một thuật toán cắt cây động. Các mô-đun như vậy đã được trực quan hóa bằng VisANT ( http://visant.bu.edu). Mẫu biểu hiện gen được cô đọng trong một mô-đun thành “mô-đun eigengene” (ME), là một bản tóm tắt có trọng số về biểu hiện gen trong mô-đun và có thể tương quan với các đặc điểm. Mối quan hệ giữa các gen trong mô-đun có thể được xác định và các phân tích tiếp theo có thể tập trung vào các gen trung tâm (gen có kết nối cao nhất trong mô-đun) và các con đường tương ứng thúc đẩy thay đổi biểu hiện gen mà không có bất kỳ giả định trước nào về chức năng của gen. Ở giai đoạn cuối, các mô-đun quan tâm được chú thích bằng cách sử dụng các danh mục chức năng và sinh học của bản thể gen (GO) bằng công cụ trực tuyến ( http://geneontology.org ). Phương pháp WGCNA đã được sử dụng trong một số lượng lớn các nghiên cứu phiên mã gần đây để tiết lộ mạng lưới gen chức năng [ 34 , 35 ].

phân tích qPCR

Các sản phẩm gen đã chọn được tìm thấy bằng phân tích microarray bị ảnh hưởng bởi CBD đã được xác nhận bởi qPCR như được mô tả [ 26 , 30 ]. CDNA của mỗi gen đã chọn được khuếch đại bằng cách sử dụng một cặp mồi cụ thể được trình bày trong tệp Bổ sung 1 : Bảng S1. Sản phẩm gen β2-microglobulin (β2mg) được sử dụng để bình thường hóa [ 30 ]. Các lần chạy qPCR được lặp lại 3–4 lần bằng cách sử dụng các chế phẩm mRNA từ các thí nghiệm độc lập.

Xét nghiệm ELISA

Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym (ELISA) đã được thực hiện như đã mô tả trước đó [ 24 ]. Trong thời gian ngắn, các tế bào T _MOG được nuôi cấy trong môi trường xét nghiệm trong các đĩa 24 giếng (0,25 × 10 ⁶ tế bào / giếng) cùng với APC lách (5 × 10 ⁶ tế bào / giếng). CBD ở 5 μM được thêm vào các tế bào ngay trước khi bổ sung MOG35-55 ở 5 μg / ml. Sau 24 giờ ủ, môi trường điều hòa tế bào được thu thập, chia nhỏ và phân tích nồng độ IL-1β và IL-3 bằng ELISA ( R&D Systems , Minneapolis, MN, USA). Thời gian ủ trong 24 h được chọn dựa trên các quan sát trước đây của chúng tôi [ 24 ].

Phân tích thống kê dữ liệu qPCR và ELISA

Dữ liệu qPCR và ELISA được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± SEM của 3–4 thí nghiệm độc lập và được phân tích ý nghĩa thống kê bằng cách sử dụng phân tích phương sai một cách (ANOVA), tiếp theo là bài kiểm tra sau học của Newman-Keul. p  <0,05 được coi là có ý nghĩa. Chương trình Graph Pad Prism (La Jolla, CA, USA) được sử dụng để phân tích thống kê dữ liệu.

Hồ sơ biểu hiện gen của các tế bào T _MOG hoạt hóa được điều trị bằng CBD

Gần đây chúng tôi đã mô tả hồ sơ biểu hiện gen chi tiết của T _MOG được kích hoạt bởi MOG35-55 [ 29 ] và chứng minh tác dụng tiền viêm mạnh mẽ của sự hoạt hóa MOG35-55 ở cấp độ phiên mã xác nhận chức năng Th17 của các tế bào T _{MOG đã} được hoạt hóa [ 24 , 26 ].

Ở đây, chúng tôi đã xem xét tác động của đồng ủ CBD lên cấu hình phiên mã gây ra MOG35-55 của T _MOG . Mẫu mRNA được chế biến từ tinh khiết T _MOG tế bào (CD4 ⁺ lựa chọn tích cực), đồng nuôi trước đó với trước gắn APC, và kích thích với MOG35-55 lúc 5 mg / ml trong 8 h trong sự hiện diện hay vắng mặt của CBD tại 5 μM.

Phân tích microarray dựa trên ngưỡng p  <0,005 cho thấy 2755 bảng điểm (trong khoảng 25.600 mục tiêu hiện diện trên bộ Illumina này ) được điều chỉnh khác biệt giữa các phương pháp điều trị. Trong số này, kích thích với MOG35-55 đã điều chỉnh sự biểu hiện của 842 bản sao gen và 1094 đầu dò gen được điều hòa (Hình. 1a). Việc bổ sung CBD vào các tế bào T _{MOG được} kích thích bằng MOG35-55 đã dẫn đến tổng số 968 bản sao gen điều chỉnh và trong 1330 bản sao điều chỉnh giảm so với mẫu đối chứng (không có CBD và MOG35-55). Trong số này, 81 sản phẩm gen được điều hòa đáng kể ( p  <0,005) bằng cách bổ sung CBD và 82 sản phẩm gen được điều hòa bởi CBD so với mức được quan sát thấy trong các tế bào được kích thích MOG35-55 không có CBD (Hình. 1b). Tế bào T _{MOG được} kích thích bằng MOG35-55 đơn lẻ hoặc được đồng ủ với CBD có chung 627 sản phẩm gen điều hòa và 852 gen điều hòa. Hai mươi tám bản sao được điều hòa và 30 bản sao điều chỉnh giảm trong các tế bào T _{MOG được} ủ với CBD được cung cấp một mình hoặc bằng sự kết hợp CBD + MOG35-55. Chỉ có một sản phẩm gen được điều chỉnh giảm bởi kích thích chỉ MOG35-55 và điều trị chỉ bằng CBD. Điều thú vị là, 13 bảng điểm cá nhân luôn được điều chỉnh và 37 bảng điểm luôn được điều chỉnh giảm trong mọi điều kiện thí nghiệm.

Hình 1

Số lượng bản mã gen bị ảnh hưởng trong các tế bào T _{MOG được} kích thích bằng MOG35-55 khi có hoặc không có CBD. mRNA được chuẩn bị từ tế bào T _{MOG được} đồng nuôi cấy với APC và được kích thích bằng MOG35-55 khi có hoặc không có CBD được phân tích microarray như mô tả trong Phương pháp. Số lượng các bản sao được thể hiện một cách khác biệt được điều chỉnh tăng đáng kể ( màu đỏ ) hoặc điều chỉnh giảm ( màu xanh lá cây ) trong các điều kiện điều trị khác nhau so với các tế bào không được điều trị đối chứng ( p  <0,005). b Biểu đồ Venn minh họa số lượng các bản sao bị ảnh hưởng (điều hòa lên và xuống) bởi các nghiệm thức CBD, MOG35-55 hoặc CBD + MOG35-55 ( tr <0,005) và sự chồng chéo của chúng

Tạo gen bằng phân tích gen

Chỉ các gen đạt tiêu chuẩn p  <0,005 và thay đổi lần lượt là 0,2 (tức là thay đổi 20%) mới được đưa vào phân tích sâu hơn về ảnh hưởng của CBD đối với hoạt động phiên mã của T _{MOG được} kích thích . Một số phương pháp tiếp cận đã được sử dụng để mô tả đặc điểm điều chế CBD của sự hoạt hóa tự kháng nguyên của T _MOG . Những điều này bao gồm (1) nhận dạng các bảng điểm ức chế CBD nhất trong các bảng điểm được kích hoạt bởi MOG35-55, (2) nhận dạng các bảng điểm được điều chỉnh MOG35-55 không bị ảnh hưởng bởi CBD, (3) xác định các bảng điểm được điều chỉnh CBD nhiều nhất , và (4) xác định ảnh hưởng của CBD lên các gen điều hòa MOG35-55.

Bàn 1hiển thị các bảng điểm được điều chỉnh bằng cách kích thích với MOG35-55 và giảm đáng kể khi có CBD. Những phiên mã này bao gồm: các cytokine như mRNA Il3 (giảm 72% bởi CBD), Il1b mRNA (giảm 70%), Xcl1 (giảm 49%), và Il12a (24%); mRNA của thụ thể cytokine và chemokine (ví dụ: Ifngr1 là 60%, Cxcr1 là 50%); các yếu tố phiên mã và điều hòa ( Crem 50%, Ier3 31%, Atf3 28%); TNF-các thành viên báo hiệu gia đình ( Tnfrsf18 tăng 40%, Tnfsf11 và Tnfsf14 tăng 30%, Tnfrsf9giảm 21%); các yếu tố tín hiệu bao gồm những yếu tố ảnh hưởng đến độ bám dính ( Amica1 tăng 21%), tăng trưởng ( Igfbp4 tăng 50%), cấu trúc tế bào và vận chuyển ( Vps37b 60%, Tubb2d 50%) cũng như tổng hợp và chuyển hóa lipid / cholesterol ( Dgat1 là 60% , Fdps giảm 50%). Những thay đổi này cho thấy CBD có tác động ngăn chặn sâu sắc các gen được kích hoạt MOG35-55 khác nhau trong tế bào T _MOG . Một số bản sao gen đã bị giảm bởi điều trị kết hợp CBD + MOG35-55 (chỉ so với MOG35-55) cũng bị giảm khi ủ với CBD đơn thuần ( so với đối chứng) bao gồm Il1b (70%), Cxcr1(tăng 30%), Ifngr1 (60%), Crem (50%), Tnfrs18 (50%), Igfbp4 (50%), Vps37b (60%), Tubb2b (50%), Fdps ( 50%) và Dgat1 (60%).

Điều quan trọng cần lưu ý (xem Bảng 2) rằng một số bảng điểm tiền viêm được điều chỉnh bằng MOG35-55 không bị ảnh hưởng bởi CBD (được đưa ra khi có mặt MOG35-55). Chúng bao gồm bản sao của một số cytokine (ví dụ: Csf2 , Tnf, Ifng ), chemokine điều chỉnh MOG35-55 (ví dụ, Ccl3 , Ccl4 , Cxcl10 ), glycoprotein điều tiết (ví dụ, Sema7a ), yếu tố phiên mã làm trung gian cho cơ chế dung nạp ( Egr2 , Egr1 ) và một số bộ điều chỉnh phiên mã và tín hiệu liên quan đến IFN (ví dụ: Tbx21 , Ifit3 ).

Các bản sao gen đã được điều chỉnh đáng kể khi có CBD trong các tế bào T _MOG được kích thích bằng MOG35-55 được liệt kê trong Bảng 3. Trong số các bản sao này, chúng tôi tìm thấy chủ yếu là các phân tử màng và xuyên màng được biết là điều chỉnh tiêu cực sự hoạt hóa tế bào T, ví dụ, thông qua sự gián đoạn của tương tác APC / T cũng như quá trình xử lý và trình bày kháng nguyên. Chúng bao gồm bảng điểm của Lag3 (tăng 210%), Btla (80%) và CD69 (39%). Hơn nữa, CBD được cho một mình hoặc kết hợp với MOG35-55 đã tăng cường phiên mã Trat1 (một thụ thể tế bào T ức chế CTLA-4 vận chuyển yếu tố nội bào vào màng) tương ứng là 60 và 200%. CBD có tác dụng thúc đẩy đáng kể hoạt động phiên mã của nhiều gen phụ thuộc IFN được biết đến để thực hiện các phản ứng chống tăng sinh do IFN điều khiển, bao gồm cả Mx2MRNA , Irf4 , Ifit2 , Ephx1 , Rsad2 ( Viperin ), Ets2 , Trim30 và Tyki . Ngoài ra, CBD có tác dụng nâng cao một số bản sao liên quan đến hoạt động và tín hiệu GTP, vận chuyển protein và luân chuyển trong các tế bào T như Tagap , Gfod1 , Tnfsf8 ( CD30 ), Nfatc1 , Gbp11 , Ppic , Dusp6 và Slc3a2 ( CD98 ) mARN.

Một số bản sao bao gồm chất chống oxy hóa và chống viêm cũng như các chất điều hòa âm tính của hoạt động tế bào T đã được CBD tăng lên ngay cả khi chúng không bị ảnh hưởng bởi MOG35-55. Chúng bao gồm chất vận chuyển kẽm Slc30a1 , metallothioneins ( Mt1 và Mt2 ), heme oxygenase ( Hmox1 ), và mRNA của một protein bảo quản cân bằng nội môi lưới nội chất ( Herpud1 ) (Bảng 3, Hình. 2 và Các bác sĩ cho biết:and33).

Mở trong một cửa sổ riêng

Hình 2

Các thuật ngữ chức năng làm giàu CBD do IPA xác định trong các tế bào T _MOG được kích hoạt . a Các gen hình thành chú thích ” Tăng sinh tế bào lympho T ” được phát hiện là bị ảnh hưởng bởi CBD ( b ). Các gen hình thành chú thích ” Sự khác biệt của tế bào Th17 ” được phát hiện là bị ảnh hưởng bởi CBD. Hướng thay đổi được mã hóa theo màu với màu xanh lá cây ngụ ý điều chỉnh giảm và màu đỏ ngụ ý điều chỉnh tăng. Giá trị log2 thể hiện sự thay đổi do CBD gây ra so với các ô chỉ được kích thích bởi MOG35-55 và giá trị p tương ứng được cung cấp bên dưới mỗi tên bảng điểm. Giải thích các ký hiệu được cung cấp trong Chú giải

Mở trong một cửa sổ riêng

Hình 3

Phân tích mạng lưới gen IPA về hiệu ứng CBD trong các tế bào T _{MOG được} kích thích — Mạng 1. Phân tích mạng lưới các gen biểu hiện có ý nghĩa ( p  <0,005) bị ảnh hưởng bởi CBD trong các tế bào T _MOG được kích thích bằng MOG35-55 được thực hiện bằng phần mềm IPA như được mô tả trong Phương pháp. Hiển thị mạng lưới, biểu tượng và mối quan hệ sinh học giữa các gen được giải thích trong Hình. 2. Các gen màu xám đã được hiển thị trong tài liệu để tương tác với các sản phẩm gen màu xuất hiện trong sơ đồ

Ở bước cuối cùng, chúng tôi tập trung vào bảng điểm điều chỉnh giảm MOG35-55 và nghiên cứu ảnh hưởng của CBD đối với mức độ của chúng. Bàn 4hiển thị danh sách một số bảng điểm bị ức chế MOG35-55 cao mà không bị ảnh hưởng bởi CBD. Danh sách bao gồm các đại diện của các họ gen và chức năng khác nhau. Điều thú vị là, sự kích hoạt MOG35-55 dẫn đến sự giảm đáng kể trong quá trình phiên mã của một số thụ thể IL-17 ( Il17re , biến thể phiên mã 2 , Il17re biến thể 1 và Il17rc ; xem thêm [ 29 ]) và sự điều hòa giảm này không bị ảnh hưởng bởi sự hiện diện của Khu trung tâm.

Xác định các mạng chức năng bị ảnh hưởng bởi CBD trong T _MOG được kích hoạt

Như đã mô tả ở trên, việc xử lý CBD đối với các tế bào T _MOG được xử lý bằng MOG35-55 dẫn đến điều hòa 81 bản sao và điều chỉnh giảm 82 bản sao. Các gen này được tải lên chương trình phân tích IPA để xác định các tập hợp con chức năng, con đường, mạng lưới gen và các cơ quan điều hòa ngược dòng mà CBD nhắm mục tiêu. Nhân vật 2minh họa hai thuật ngữ chức năng GO làm giàu CBD được IPA xác định trong các tế bào _MOG T được hoạt hóa , “ Tăng sinh tế bào lympho T ” (Hình. 2a) và “ Sự khác biệt của các tế bào Th17 ” (Hình. 2b). Các “ phổ biến vũ khí của bào lympho T ” chú thích chức năng đã được công nhận bởi IPA được upregulated trong hoạt T _MOG là kết quả của CBD đồng ủ bệnh do phiên mã upregulated của Pycard , Ptpn6 , Gfi1 , Hmox1 , Btla , Lag3 , Il21 , Slc3a2 và Vav3 mRNA và do sự triệt tiêu song song của Tg , Dusp10 , Socs3 , Tsc22d3 , Ifngr1 , Tnfsf18 , Cd40 , Il1b ,MRNA Ubash3a và Srf (Hình. 2a). Ngoài ra, trong “ Cách phân biệt TH17 tế bào ” chú thích, IPA phân loại upregulated Il21 , Ptpn6 , Slc3a2 và downregulated Il1b , Socs3 , và Ifngr1 bảng điểm và nhận ra nó bị dập tắt bởi CBD trong kích thích T _MOG (Hình. 2b).

Phân tích IPA đã xác định một số con đường kinh điển khác bị ảnh hưởng bởi CBD trong T _{MOG được} kích thích bởi MOG35-55 (Bảng 5). Chúng bao gồm “ tín hiệu IL-10 ” và “ tín hiệu IL-6 ” ( p  <0,005), tiếp theo là “ tín hiệu qua trung gian cAMP ”, “ tín hiệu IGF-1 ”, “ thực bào qua trung gian thụ thể Fcg trong đại thực bào và bạch cầu đơn nhân ”, “ Siêu đường dẫn sinh tổng hợp cholesterol ”và con đường“ biệt hóa tế bào T trợ giúp ”(p <0,05).

IPA đã xác định mạng lưới gen bị ảnh hưởng bởi CBD trong các tế bào _MOG T được kích thích bằng MOG35-55 (Hình. 3 và Các bác sĩ cho biết:và 4).4). Trong các mạng gen này, IPA biểu thị các bộ điều hòa ngược dòng chính có chức năng được điều chỉnh bởi CBD. Theo đó, Mạng 1 (Hình. 3) liên kết các tác động của CBD với điều chế IL-4, STAT5B, SATB1, CD28, NRF2 / NFE2L2 và NRF1 trong khi Mạng 2 (Hình. 4) liên kết các tác động của CBD với IL-2 và IL-1β cũng như với NFKB1 và EGR2.

Mở trong một cửa sổ riêng

Hình 4

Phân tích mạng gen IPA về điều chế CBD của các tế bào T _{MOG được} kích thích — Mạng 2. Xem Hình. 2 và Các bác sĩ cho biết:and33 để biết chi tiết

Nhìn chung, chúng tôi cho thấy ở đây có nhiều cytokine, chemokine, thụ thể và các con đường truyền tín hiệu được điều chỉnh bởi CBD (Bảng 1, Hình. 1 và Các bác sĩ cho biết:và 2)2) so với quy định (Bảng 3) phù hợp với việc giảm sự tăng sinh tế bào T _MOG và chức năng Th17 của chúng được chúng tôi cho thấy trước [ 12 , 24 ]. Tuy nhiên, trong số các gen điều hòa, chúng tôi tìm thấy chủ yếu các phân tử tế bào T điều hòa được biết là có tác dụng ức chế sự tăng sinh và hoạt động của tế bào T.

Xác thực bởi ELISA và qPCR

Một số sản phẩm gen được xác định bằng phân tích microarray là được điều chỉnh khác biệt đã được xác nhận bởi qPCR sử dụng β2-microglobulin làm gen tham chiếu) hoặc bằng ELISA (để định lượng sự tiết protein). Nhân vật 5acho thấy rằng sự kích thích T _MOG với MOG35-55 dẫn đến tăng tiết protein IL-1β và việc ủ chung với CBD làm giảm nó trở lại mức kiểm soát. Hơn nữa, T _MOG kích thích với MOG35-55 tăng bài tiết IL-3 bởi khoảng mười lần và mức này đã được dập tắt bởi CBD bằng 40% (Hình. 5b).

Hình 5

ELISA của các cytokine IL-1β và IL-3 được giải phóng từ các tế bào T _{MOG được} kích thích bằng MOG35-55 khi có hoặc không có CBD. APC / T _MOG được kích thích với MOG35-55 ở 5 μg / ml trong 24 giờ khi có hoặc không có CBD ở 5 μM và lượng ( a ) IL-1β và ( b ) IL-3 trong môi trường nuôi cấy được xác định . 100% tương đương với hiệu ứng MOG35-55 tối đa, nghĩa là 15 ± 6 pg / ml đối với IL-1β và đến 377 ± 100 pg / ml đối với IL-3. Thống kê (một chiều ANOVA) và ký hiệu: a F (3,6) = 6,7, p  <0,05. b F (3,15) = 80,25, p  <0,001; Ký hiệu: ^# p  <0,05, ^### p <0,01 so với Kiểm soát, * p  <0,05, *** p  <0,001 so với các tế bào được kích thích MOG-35-55

Bàn 6cho thấy các ví dụ về phân tích qPCR của các sản phẩm gen đã chọn trong các tế bào T _{MOG được} kích thích . Kích thích T _MOG với MOG35-55 dẫn đến sự điều chỉnh cao mức mRNA của chemokine Xcl1 (62,7 lần) và mức này đã bị CBD ức chế khoảng bốn lần. Sự biểu hiện của Il12a cũng tăng lên bởi MOG35-55 (4,3 lần) và giảm xuống 2,6 lần khi CBD được thêm vào các tế bào T _{MOG được} kích thích bằng MOG35-55 . Sự kích thích của các tế bào T _MOG với MOG35-55 cũng tăng lên biểu hiện của Dusp6gấp 2,4 lần, tăng gấp 2,4 lần khi đồng ủ với CBD (khoảng 40%). Bảng cũng cho thấy một số gen khác mà quá trình phiên mã đã được tăng cường đáng kể chỉ nhờ CBD bao gồm Btla, Lag3 và Irf4 . Phiên mã của Btla, Lag3 và Irf4 được tăng thêm khi MOG35-55 và CBD được thêm vào cùng nhau. Điều thú vị là Il10 mRNA chỉ được tăng lên khi MOG35-55 và CBD được áp dụng cùng nhau nhưng không tuân theo MOG35-55 hoặc CBD được cho riêng lẻ. Những quan sát này phù hợp với biểu hiện mRNA được quan sát bằng phương pháp cấu hình gen.

Phân tích mạng lưới đồng biểu hiện gen có trọng số (WGCNA)

Chúng tôi đã áp dụng phân tích và phân nhóm WGCNA để bổ sung cho đặc điểm chức năng của những thay đổi trong biểu hiện gen do CBD gây ra trong T _MOG được kích hoạt . Như đã đề cập trong Phương pháp, WGCNA phân cụm các bảng điểm liên quan đến chức năng thành các mô-đun theo cách không giám sát dựa trên mẫu biểu thức trên các mẫu. Kết quả của sự phân nhóm này có thể được xem như một biểu đồ dendrogram (Hình. 6a) trong đó mỗi nhánh tương ứng với một nhóm gen đồng biểu hiện (một mô-đun) được chỉ định một màu và sẽ được gọi bằng màu của nó trong phần còn lại của bản thảo.

Mở trong một cửa sổ riêng

Hình 6

Các mô-đun gen được phân nhóm WGCNA và mối tương quan của chúng với hiệu ứng CBD trong các tế bào T _{MOG được} kích thích bằng MOG35-55 . Phân tích WGCNA xác định các mô-đun riêng biệt của các gen cùng biểu hiện. một biểu đồ Dendrogram cho thấy sự chồng chéo cấu trúc liên kết của các gen và mối quan hệ của chúng với các mô-đun được mã hóa màu bên dưới. b phân cụm các mô-đun kết quả. Khung màu cho biết các mô-đun chính có tương quan tích cực ( khung đỏ ) và tiêu cực ( khung xanh lục ) tương quan với hiệu ứng CBD trong T _{MOG được} kích thích bằng MOG35-55 . c đồ thị mối quan hệ mô-đun-đặc điểm cho thấy mối tương quan của Spearman giữa các thành phần chính của mô-đun (hay còn gọi là mô-đun eigengenes [ME]; tronghàng mã màu ) và các phương pháp xử lý. Các giá trị hàng đầu trong mỗi hình vuông tượng trưng cho hệ số tương quan giữa ME và điều trị. Các giá trị dưới trong ngoặc là có liên quan p giá trị. Các mô-đun có tương quan cao với điều trị CBD + MOG35-55 được nhấn mạnh bằng cách sử dụng khung đen

Phân tích WGCNA đã nhóm các bảng điểm bị ảnh hưởng thành 36 mô-đun rời rạc (Hình. 6b). Tương quan Pearson của các mô-đun này cho thấy các mô-đun có tương quan đáng kể nhất với mỗi phương pháp điều trị (Hình. 6c). Các darkgrey mô-đun đã được chứng minh là có những tiêu cực đến hầu hết các tương quan ( r  = -0,5, p  = 0,05) và yellowgreen như tương quan tích cực nhất ( r  = 0,71, p  = 0,002) để kết hợp điều trị CBD + MOG35-55. Điều này trái ngược với hiệu ứng MOG35-55 trong đó mô-đun đồng biểu hiện gen darkgrey được công nhận là có tương quan thuận ( r  = 0,088, p  = 0,7) và mô-đun vàng xanh có tương quan nghịch ( r  = 0,35, p  = 0,2). Điều này chỉ ra rằng CBD đảo ngược các mô hình tương tác gen gây ra bởi sự kích thích MOG35-55 của T_MOG . Để tìm kiếm cách giải thích chức năng của các liên kết này, chúng tôi đã chú thích các mô-đun tương quan CBD + MOG35-55 với các danh mục GO để làm nổi bật các chức năng sinh học chính được liên kết với hiệu ứng CBD trong các tế bào T _{MOG được} kích thích . Các loại GO được xác định trong mô-đun darkgrey (chứa 94 gen Tệp bổ sung 1 : Bảng S2) dường như có liên quan chủ yếu với “ quá trình xử lý kháng nguyên và trình bày kháng nguyên peptit ngoại sinh thông qua MHC lớp II ” (GO: 0019882, GO: 0002504 GO: 0019886 ĐI: 0002495 ĐI: 0002478 ĐI: 0019884). Điều này có thể là do sự đại diện cao trong mô-đun này của các gen quy định quá trình xử lý kháng nguyên, ví dụ, H2-Ab1, CD9, Tmem66, CD74, Tlr2 và Fcrla. Các danh mục GO khác được xác định trong mô-đun darkgrey này bao gồm “ quá trình hệ thống miễn dịch ” (GO: 0002376), “ phản ứng phòng vệ ” (GO: 0006952), “ phản ứng viêm ” (GO: 0006954), “ quá trình trao đổi chất nitơ phản ứng ” (GO : 2001057), “ quy định sản xuất chemokine ” (GO: 0032642, tất cả trong thuật ngữ Quy trình sinh học), và “ ràng buộc ” (GO: 0005488; trong thuật ngữ Chức năng phân tử).

Các yellowgreen mô-đun (chứa 48 gen tập tin bổ sung 1 : Bảng S2) bao gồm gen như Ptpnm2, Slc30a1 và Btla. Phân tích GO đã điều chỉnh các thuật ngữ được chỉ định màu vàng xanh thành “ điều chỉnh các quá trình của hệ thống miễn dịch ” (GO: 0002682), “ phản ứng với kích thích ” (GO: 0048583), “ tín hiệu ” (GO: 0023051), “ giao tiếp tế bào ” (GO: 0010646) , “Sự kết dính tế bào ” (GO: 0030155), “ truyền tín hiệu ” (GO: 0009966; trong thuật ngữ Quy trình sinh học), “ hoạt động của yếu tố trao đổi guanyl-nucleotide ” (GO: 0005085; trong thuật ngữ Chức năng phân tử) và “ bên ngoài của màng sinh chất”(GO: 0009897; Điều khoản thành phần di động). Tóm lại, phân tích WGCNA đã chứng minh rằng tác dụng chính của CBD là hạn chế sự hoạt hóa MOG35-55 của T _MOG chủ yếu bằng cách nhắm mục tiêu các quá trình điều chỉnh quá trình xử lý và trình bày kháng nguyên.

Dòng tế bào T _MOG được cung cấp bởi phòng thí nghiệm của Giáo sư Avraham Ben-Nun từ Khoa Miễn dịch học tại Viện Khoa học Weizmann, Rehovot, Israel.

Các tệp bổ sung

Tệp bổ sung 1: Bảng S1. ^{(234K, doc)}

Danh sách các đoạn mồi được sử dụng để xác nhận qPCR mức mRNA của các gen đã chọn trong tế bào T _{MOG đã} được tinh sạch . Bảng S2. WGCNA giao nội dung gen của yellowgreen và darkgrey mô-đun, phân loại như là tương quan nhất với điều trị CBD trong MOG35-55 kích thích T _MOG . (DOC 233 kb)

Biên tập

Đây thực sự là một thời điểm thú vị để nghiên cứu về miễn dịch học. Những khám phá nổi bật gần đây trên một số khía cạnh đang mở ra một thời đại mới của phương pháp trị liệu miễn dịch hứa hẹn rất nhiều với tiềm năng cung cấp các lựa chọn cho những bệnh nhân không có cơ hội. Những mặt trận này bao gồm những khám phá về lộ trình điểm kiểm tra miễn dịch protein-1 (PD-1) chết tế bào được lập trình, trục ROR γt-Th 17-IL-17 và vai trò của nó trong bệnh tự miễn, vai trò của cannabinoids và các thụ thể của chúng trong chứng viêm

Việc phát hiện ra PD-1 và phối tử của nó, PD-L1 và PD-L2, nhanh chóng dẫn đến nhận ra rằng các tế bào khối u sử dụng phối tử PD-1 để điều chỉnh phản ứng của tế bào T và thoát khỏi sự phát hiện và tấn công miễn dịch. Nhận thức này đến từ phát hiện ra rằng biểu hiện PD-L1 được phát hiện trong nhiều bệnh ung thư nhưng không phải ở các mô bình thường [1]. Hơn nữa, biểu hiện PD-L1 hoặc PD-L2 của các tế bào khối u được phát hiện có liên quan đến tiên lượng xấu hơn và giảm khả năng sống sót. Ở cả bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ và ung thư tế bào hắc tố, mức độ PD-1 cao hơn được quan sát thấy trên các tế bào Lympho thâm nhiễm khối u (TIL) so với các tế bào lympho đang lưu hành [2]. Cuối cùng, có mối tương quan nghịch giữa biểu hiện PD-L2 của khối u và sự hiện diện của CD8 + TIL trong ung thư thực quản [3]. Tất cả những phát hiện này đã dẫn đến việc các công ty dược phẩm đổ xô phát triển các kháng thể đối với PD-1 hoặc các phối tử của nó để phong tỏa lộ trình trạm kiểm soát PD-1. Trong số các kháng thể này, nivolumab (Bristol-Myers Squibb), một kháng thể đơn dòng IgG4 hoàn toàn ở người chống lại PD-1, là loại tiên tiến nhất trong phòng khám. Trong nghiên cứu giai đoạn I, tỷ lệ đáp ứng khách quan là 31% trong thời gian trung bình là hai năm ở bệnh nhân ung thư hắc tố tiến triển [4]. Thời gian sống thêm trung bình ở những bệnh nhân được điều trị bằng nivolumab là 16,8 tháng, và tỷ lệ sống thêm 1 và 2 năm lần lượt là 62% và 43%. Trong một nghiên cứu khác với nivolumab được dùng đồng thời với Yervoy (kháng thể kháng CTLA-4) ở bệnh nhân u ác tính, tỷ lệ đáp ứng tổng thể là 53% đã được quan sát thấy [5]. Điều này cho thấy rằng hiệu quả thậm chí có thể cao hơn khi nhắm mục tiêu nhiều điểm kiểm tra trong khi các tác dụng phụ vẫn có thể kiểm soát được. Trạm kiểm soát PD-1 cũng đang được nhắm mục tiêu kết hợp với vắc xin và các liệu pháp miễn dịch khác để tối ưu hóa phản ứng lâm sàng. Tuy nhiên, vẫn còn những câu hỏi về việc nhắm mục tiêu trạm kiểm soát PD-1. Một câu hỏi quan trọng là liên quan đến cơ chế chịu trách nhiệm cho các phản ứng chống khối u ở những bệnh nhân có khối u âm tính với PDL-1.

Việc phát hiện ra tế bào Th17 và sinh học của chúng đã nâng cao đáng kể hiểu biết của chúng ta về cơ chế bệnh sinh của nhiều bệnh viêm nhiễm ở người, do đó mở ra một cơ hội mới cho sự phát triển của thế hệ tiếp theo của liệu pháp điều trị chống viêm. Sự tham gia của các tế bào Th17 và các cytokine IL-17A / F, IL-21 và IL-22 của chúng trong chứng viêm trở nên rõ ràng từ các nghiên cứu chứng minh sự hiện diện của một lượng lớn các tế bào này và các cytokine liên quan trong mô bệnh cũng như sự hiện diện của cao mức IL-17 trong huyết thanh của bệnh nhân mắc bệnh tự miễn so với người không mắc bệnh. Hơn nữa, các kháng thể với IL-17 có thể làm giảm bớt các dấu hiệu của bệnh ở một số mô hình động vật [6,7]. Kể từ những nghiên cứu ban đầu này, một số kháng thể nhắm mục tiêu IL-17A (AIN457, LY2439821), IL-17F, IL-17R và IL-23, đã đi vào thử nghiệm lâm sàng và cho đến nay đã cho thấy hiệu quả rõ rệt trong bệnh viêm khớp và bệnh vẩy nến [8- 10]. Tuy nhiên, đáng ngạc nhiên là việc nhắm mục tiêu IL-17 với các kháng thể đã cho thấy các kết quả khác nhau trong các mô hình động vật bị bệnh viêm ruột (IBD). Hơn nữa, kết quả từ các thử nghiệm lâm sàng của brodalumab (anti IL-17R) và secukinumab (anti IL-17A) trong bệnh Crohn không cải thiện được các triệu chứng bệnh, và thậm chí làm trầm trọng thêm bệnh ở một số bệnh nhân [11] cho thấy vai trò của tế bào Th17 và IL -17A dường như phức tạp hơn suy nghĩ ban đầu.

Việc phát hiện ra thụ thể hormone hạt nhân, RORγt, là cơ quan điều hòa chính của quá trình biệt hóa tế bào Th17 và tiết IL-17 cho thấy mục tiêu điều trị đối với các phân tử nhỏ chống lại trục IL-23 / IL-17. Không giống như các kháng thể nhắm vào các cytokine cụ thể, các chất đối kháng RORγt có thể làm giảm phổ đầy đủ của các cytokine liên quan đến Th17. Hơn nữa, các chất đối kháng của RORγt có nhiều khả năng làm giảm các cytokine liên quan đến Th17 hơn là ngăn chặn các cytokine này như đặc trưng của các kháng thể. Điều này sẽ cho phép một số mức độ hoạt động của IL-17 dường như cần thiết trong ruột để bảo vệ chống lại nhiễm nấm. Vì những lý do này, thuốc đối kháng RORγt có thể có hiệu quả khi liệu pháp kháng thể thất bại. Tiết lộ này đã dẫn đến một cuộc đua cạnh tranh cao giữa các công ty dược phẩm lớn và các công ty dược phẩm mới thành lập để phát triển các chất đối kháng phân tử nhỏ của RORγt. Cho đến nay, có rất nhiều chất đối kháng RORγt đang trong giai đoạn phát triển tiền lâm sàng và một loại do Orphagen và Japan Tobacco Inc. phát triển gần đây đã được đưa vào thử nghiệm lâm sàng. Các hợp chất này không chỉ cho thấy hoạt động ức chế chống lại sự biệt hóa tế bào Th17 và sản xuất IL-17, mà còn chứng minh mức độ hiệu quả khác nhau trong các mô hình bệnh vẩy nến và viêm não tự miễn thực nghiệm [12,13]. Các phân tử nhỏ tổng hợp dường như không phải là nguồn duy nhất của các chất đối kháng RORγt. Điều thú vị là thiên nhiên cũng đã tạo ra các phân tử có hiệu quả đối kháng với RORγt. Gần đây, sản phẩm tự nhiên, axit ursolic (UA), đã được phát hiện có tác dụng ức chế chọn lọc và hiệu quả chức năng của RORγt, dẫn đến giảm đáng kể biểu hiện IL-17 ở cả tế bào Th17 đang phát triển và biệt hóa [14]. Hơn nữa, điều trị viêm não tủy tự miễn thực nghiệm được cải thiện UA do đó cho thấy UA có thể là một ứng cử viên thuốc hoặc hợp chất dẫn đầu có giá trị để phát triển các phương pháp điều trị cho các bệnh viêm và ung thư qua trung gian Th17. Dựa trên những phát hiện này, rất gần đây, Đại học California Davis phối hợp với Visionary Pharmaceuticals đã bắt đầu thử nghiệm lâm sàng UA để điều trị viêm đường mật xơ cứng nguyên phát. Các kết quả của thử nghiệm này đang được mong đợi giống như kết quả từ các thử nghiệm sắp tới về chất đối kháng RORγt tổng hợp trong giai đoạn phát triển tiền lâm sàng. Đại học California Davis phối hợp với Visionary Pharmaceuticals đã bắt đầu thử nghiệm lâm sàng UA để điều trị viêm đường mật xơ cứng nguyên phát. Các kết quả của thử nghiệm này đang được mong đợi giống như kết quả từ các thử nghiệm sắp tới về chất đối kháng RORγt tổng hợp trong giai đoạn phát triển tiền lâm sàng. Đại học California Davis phối hợp với Visionary Pharmaceuticals đã bắt đầu thử nghiệm lâm sàng UA để điều trị viêm đường mật xơ cứng nguyên phát. Các kết quả của thử nghiệm này đang được mong đợi giống như kết quả từ các thử nghiệm sắp tới về chất đối kháng RORγt tổng hợp trong giai đoạn phát triển tiền lâm sàng.

Biên giới thứ ba của những tiến bộ quan trọng gần đây bao gồm những phát triển quan trọng trong dược lý cannabinoid kể từ khi phát hiện ra các thụ thể cannabinoid, CB1 và CB2. Những phát triển này bao gồm các hoạt động của cannabinoids và các đối tác nội sinh của chúng, các endocannabinoids về điều hòa miễn dịch. Các cannabinoids ngoại sinh đã được chứng minh là ngăn chặn các phản ứng miễn dịch qua trung gian tế bào T chủ yếu bằng cách gây ra quá trình apoptosis và ức chế các cytokine và chemokine gây viêm trong khi tăng các cytokine chống viêm. Ví dụ, cannabinoid tự nhiên, 9-Tetrahydrocannabinol (THC), được tìm thấy để gây ra quá trình chết rụng ở các tế bào lách ngây thơ và được kích hoạt bởi mitogen trong ống nghiệm và những tác dụng do THC gây ra này có thể bị ức chế bởi các chất đối kháng CB2 [15]. Trong nghiên cứu con người, Các đại thực bào phế nang phổi bị loại bỏ khỏi những người hút cần sa bị ảnh hưởng đến khả năng sản xuất TNF, yếu tố kích thích tế bào hạt / đại thực bào và IL-6 để đáp ứng với kích thích LPS [16]. Các nghiên cứu in vitro khác gần đây cũng cho thấy tác dụng chống viêm mạnh mẽ của cannabinoids tổng hợp CP55,940 và WIN55,212-2. Cả CP55, 940 và WIN55, 212-2 đều giảm sản xuất cytokine IL-6 và IL-8 được điều chỉnh từ các tế bào hoạt dịch giống nguyên bào sợi thấp được kích thích bởi IL-1β, thông qua cơ chế trung gian không phải CB1 / CB2 [17]. Hơn nữa, một số loại này và các loại cannabinoid tổng hợp khác đã cho thấy hiệu quả trên nhiều loại mô hình động vật [18]. Ví dụ, trong một nghiên cứu, ứng dụng ACEA trong phúc mạc, một chất chủ vận chọn lọc CB1, và JWH-133, một chất chủ vận chọn lọc CB2, dầu ức chế viêm đại tràng do mù tạt và các triệu chứng sau đó như tăng trọng lượng ruột kết xa, co thắt ruột kết, tổn thương viêm, tiêu chảy và tổn thương mô học [19]. Kết quả từ những nghiên cứu này và các nghiên cứu tương tự đã thúc đẩy việc bắt đầu các thử nghiệm lâm sàng để điều trị các bệnh viêm nhiễm. Một thử nghiệm thí điểm về cần sa giàu THC dưới dạng thuốc lá trong 8 tuần đã chứng minh những lợi ích lâm sàng đáng kể so với giả dược ở những bệnh nhân bị bệnh Crohn không đáp ứng với liệu pháp điều trị bằng steroid, chất điều hòa miễn dịch hoặc các tác nhân chống hoại tử khối u [20 ]. Hiện tại, một số cannabinoid tổng hợp đang được phát triển lâm sàng bao gồm Resumab Kết quả từ những nghiên cứu này và các nghiên cứu tương tự đã thúc đẩy việc bắt đầu các thử nghiệm lâm sàng để điều trị các bệnh viêm nhiễm. Một thử nghiệm thí điểm về cần sa giàu THC dưới dạng thuốc lá trong 8 tuần đã chứng minh những lợi ích lâm sàng đáng kể so với giả dược ở những bệnh nhân bị bệnh Crohn không đáp ứng với liệu pháp điều trị bằng steroid, chất điều hòa miễn dịch hoặc các tác nhân chống hoại tử khối u [20 ]. Hiện tại, một số cannabinoid tổng hợp đang được phát triển lâm sàng bao gồm Resumab Kết quả từ những nghiên cứu này và các nghiên cứu tương tự đã thúc đẩy việc bắt đầu các thử nghiệm lâm sàng để điều trị các bệnh viêm nhiễm. Một thử nghiệm thí điểm về cần sa giàu THC dưới dạng thuốc lá trong 8 tuần đã chứng minh những lợi ích lâm sàng đáng kể so với giả dược ở những bệnh nhân bị bệnh Crohn không đáp ứng với liệu pháp điều trị bằng steroid, chất điều hòa miễn dịch hoặc các tác nhân chống hoại tử khối u [20 ]. Hiện tại, một số cannabinoid tổng hợp đang được phát triển lâm sàng bao gồm Resumab^TM bởi Corbus Pharmaceuticals cho các bệnh viêm hiếm gặp.

Rõ ràng là từ cả nghiên cứu in vitro và in vivo rằng cannabinoids có tác dụng chống viêm mạnh, phụ thuộc và độc lập với CB1 và CB2. Mặc dù người ta đã biết nhiều về tác dụng của cannabinoids đối với tế bào Th1 và chức năng của chúng, nhưng có rất ít hoặc không có thông tin về tác động của cannabinoids đối với tế bào NK, cũng như tế bào Th17 và Treg, sự cân bằng của chúng, là yếu tố quyết định nghiêm trọng đến tình trạng viêm.

Người giới thiệu

1. Dong H, Strome SE, Salomao DR, Tamura H, Hirano F, Flies DB, et al. B7-H1 liên quan đến khối u thúc đẩy quá trình tự chết của tế bào T: một cơ chế trốn tránh miễn dịch tiềm năng. Nat Med. Năm 2002; 8: 793-800.
2. Blank C, Kuball J, Voelkl S, Wiendl H, Becker B, Walter B, et al. Phong tỏa PD-L1 (B7-H1) làm tăng phản ứng của tế bào T đặc hiệu với khối u ở người trong ống nghiệm. Int J Cancer. Năm 2006; 119: 317-327.
3. Rozali EN, Hato SV, Robinson BW, Lake RA, Lesterhuis WJ. Lập trình phối tử tử 2 trong ức chế miễn dịch do ung thư. Clin Dev Immunol. 2012.
4. Topalian SL, Hodi FS, Brahmer JR, Gettinger SN, Smith DC, McDermott DF, et al. Tương quan an toàn, hoạt động và miễn dịch của kháng thể chống PD-1 trong bệnh ung thư. N Engl J Med. 2012; 366: 2443-2454.
5. Srivastava N, McDermott D. Cập nhật về lợi ích của liệu pháp miễn dịch và liệu pháp nhắm mục tiêu trong u ác tính: bối cảnh đang thay đổi. Ung thư Manag Res. 2014; 6: 279-289.
6. Miossec P, Kolls JK. Nhắm mục tiêu tế bào IL-17 và TH17 trong tình trạng viêm mãn tính. Nat Rev Ma túy Discov. 2012; 11: 763-776.
7. Fitzpatrick LR. Ức chế IL-17 như một phương pháp tiếp cận dược lý đối với IBD. Int Rev Immunol. Năm 2013; 32: 544-555.
8. Hueber W, Patel DD, Dryja T, Wright AM, Koroleva I, Bruin G, et al. Tác dụng của AIN457, một kháng thể hoàn toàn của con người đối với interleukin-17A, đối với bệnh vẩy nến, viêm khớp dạng thấp và viêm màng bồ đào. Khoa học dịch thuật Med. Năm 2010; 2: 52-72.
9. Genovese MC, Van den Bosch F, Roberson SA, Bojin S, Biagini IM, Ryan P, et al. LY2439821, một kháng thể đơn dòng kháng interleukin-17 được nhân bản hóa, trong điều trị bệnh nhân viêm khớp dạng thấp: Một nghiên cứu ngẫu nhiên, mù đôi, có đối chứng với giả dược, giai đoạn I. Viêm khớp Thấp khớp. Năm 2010; 62: 929-939.
10. Papp KA, Leonardi C, Cố vấn A, Ortonne JP, Krueger JG, Kricorian G, et al. Brodalumab, một kháng thể chống thụ thể interleukin-17 cho bệnh vẩy nến. N Engl J Med. 2012; 366: 1181-1189.
11. Hueber W, Sands BE, Lewitzky S, Vandemeulebroecke M, Reinisch W, Higgins PDR, et al. Secukinumab, một kháng thể đơn dòng kháng IL-17A ở người, cho bệnh Crohn từ trung bình đến nặng: kết quả bất ngờ của một thử nghiệm ngẫu nhiên, mù đôi có đối chứng với giả dược. Ruột. 2012; 61: 1693–700.
12. Chang MR, Lyda B, Kamenecka TM, Griffin PR. Dược lý ức chế thụ thể hạt nhân mồ côi liên quan đến thụ thể axit retinoic? Là phương pháp điều trị trong mô hình thử nghiệm viêm khớp do collagen. Viêm khớp Rheumatol Hoboken NJ. 2014; 66: 579–588.
13. Skepner J, Ramesh R, Trocha M, Schmidt D, Baloglu E, Lobera M, et al. Sự ức chế dược lý đối với RORt điều chỉnh sự biểu hiện gen chữ ký Th17 và ngăn chặn tình trạng viêm da in vivo. J Immunol. 2014; 192: 2564-2575.
14. Xu T, Wang X, Zhong B, Nurieva RI, Ding S, Dong C. Axit ursolic ngăn chặn interleukin-17 (T1, Wang X, Zhong B, Nurieva RI, Ding S, Đông C. Axit ursolic ngăn chặn interleukin-17 (IL -17) sản xuất bằng cách đối kháng chọn lọc chức năng của protein RORgamma t. J Biol Chem. 2011; 286: 22707-22710.
15. McKallip RJ, Lombard C, Martin BR, Nagarkatti M, Nagarkatti PS. Quá trình apoptosis do Delta (9) -tetrahydrocannabinol gây ra ở tuyến ức và lá lách như một cơ chế ức chế miễn dịch in vitro và in vivo. J Pharmacol Exp Ther. Năm 2002; 302: 451-465.
16. Baldwin GC, Tashkin DP, Buckley DM, Park AN, Dubinett SM, Roth MD. Cần sa và cocaine làm suy giảm chức năng của đại thực bào phế nang và sản xuất cytokine. Am J Respir Crit Care Med. Năm 1997; 156: 1606-1613.
17. Selvi E, Lorenzini S, Garcia Gonzalez E, Maggio R, Lazzerini PE, Capecchi PL, et al. Tác dụng ức chế của cannabinoids tổng hợp trên sản xuất cytokine trong các tế bào hoạt dịch giống nguyên bào sợi dạng thấp. Clin Exp Rheumatol. Năm 2008; 26: 574-581.
18. Nagarkatti P, Pandey R, Rieder SA, Hegde VL, Nagarkatti M. Cannabinoids làm thuốc chống viêm mới. Med Chem trong tương lai. Năm 2009; 1: 1333-1349.
19. Kimball ES, Schneider CR, Wallace NH, Hornby PJ. Thuốc đồng vận của thụ thể cannabinoid 1 và 2 ức chế chứng viêm đại tràng thực nghiệm do dầu mù tạt và dextran sulfat natri gây ra. Am J Physiol Thuốc tiêu hóa gan Physiol. Năm 2006; 291: 364–371.
20. Naftali T, Bar-Lev Schleider L, Dotan I, Lansky EP, Sklerovsky Benjaminov F, Konikoff FM, et al. Cần sa gây ra phản ứng lâm sàng ở bệnh nhân mắc bệnh Crohn: một nghiên cứu tiền cứu có đối chứng với giả dược. Clin Gastroenterol Hepatol Tắt Clin Pract J Am Gastroenterol PGS.TS. Năm 2013; 11: 1276–1280.