trừu tượng

Giới thiệu

Cần sa sativa là nguồn tự nhiên của một tập hợp ít nhất bảy mươi hợp chất C ₂₁ được gọi chung là phytocannabinoids (xem ElSohly và Slade, 2005 ). Cho đến nay, nghiên cứu dược lý đã tập trung chủ yếu vào chỉ ba trong số các hợp chất này. Một trong số đó là Δ ⁹ -tetrahydrocannabinol, các thành phần thần kinh chính của cần sa, những người khác là phytocannabinoid phi thần kinh, cannabidiol và Δ ⁹ -tetrahydrocannabivarin, mà ở liều thấp có thể ngăn chặn những hành động thụ trung gian cannabinoid của Δ ⁹ -tetrahydrocannabinol (see Pertwee, 2008 ). Cả ⁹-tetrahydrocannabinol và cannabidiol có trong một loại thuốc hiện được cấp phép, Sativex® và Δ ⁹ -tetrahydrocannabivarin có tiềm năng điều trị để kiểm soát các rối loạn như béo phì và lệ thuộc thuốc (xem Pertwee, 2008 ). Điều quan trọng là có nhiều nghiên cứu hướng vào việc khám phá dược lý của nhiều loại cannabinoids khác có trong cần sa, nhất là bởi vì nghiên cứu này sẽ giúp xác định bất kỳ ứng dụng điều trị bổ sung nào của các phytocannabinoids này, các hợp chất được mô tả trong tiêu đề của một bài bình luận gần đây về BJP như ‘một kho báu dược lý bị lãng quên’ ( Mechoulam, 2005 ).

Cuộc điều tra hiện nay tập trung vào các phytocannabinoid ít được nghiên cứu, cannabigerol ( Hình 1 ) mà lần đầu tiên được phát hiện trong cần sa và tổng hợp bởi Gaoni và Mechoulam (1964 ) và sau đó tìm thấy không để tạo ra Δ ⁹ -THC giống như hiệu ứng psychopharmacological in vivo ( Grunfeld và Edery, 1969 ; Mechoulam và cộng sự , 1970 ). Mục tiêu chính của chúng tôi là xác định xem hợp chất này có thể kích hoạt hoặc chặn bất kỳ thụ thể kết hợp protein G nào như được chỉ định bằng cách kích thích [ ³⁵S] GTPγS liên kết với toàn bộ màng não của chuột hoặc bằng cách phong tỏa sự kích thích đó khi điều này được gây ra bởi một hợp chất khác. Chúng tôi cũng đã nghiên cứu khả năng cannabigerol thay thế [ ³ H] CP55940 cả từ các vị trí gắn CB ₁ trong các màng này và từ các vị trí gắn CB ₂ trong các màng được chuẩn bị từ các tế bào buồng trứng của chuột đồng Trung Quốc (CHO) được truyền với thụ thể CB _{2 của người} (theo danh pháp thụ thể Alexander và cộng sự , 2008 ). Một số thí nghiệm của chúng tôi đã được thực hiện với chuột bị cô lập vas deferens, một mô trong đó chất chủ vận thụ thể cannabinoid có thể ức chế các cơn co thắt gợi lên bằng điện ( Devane et al. , 1992 ;Pertwee và cộng sự. , 1995 ). Họ được cho là để làm điều này bằng cách nhắm mục tiêu prejunctional thần kinh cannabinoid CB ₁ thụ một cách ức chế thần kinh phát hành của dẫn truyền thần kinh co, ATP và noradrenaline ( Trendelenburg et al. , 2000 ; thấy von Kügelgen và Starke, 1991 ; Pertwee, 1997 ; SCHLICKER và Kathmann, 2001 ).

Hình 1

Cấu trúc hóa học của cannabigerol.

Các kết quả mà chúng tôi thu được đã mở rộng một phát hiện gần đây rằng cannabigerol có thể kích hoạt các kênh tiềm năng thụ thể tạm thời TRPA1 và ngăn chặn sự kích hoạt các kênh tiềm năng thụ thể tạm thời TRPM8 trong ống nghiệm ( De Petrocellis et al. , 2008 ) bằng cách cung cấp bằng chứng rằng nó thực sự có thể nhắm mục tiêu protein G nhất định. thụ thể kết hợp. Một số kết quả được mô tả trong bài viết này đã được trình bày cho Hiệp hội nghiên cứu Cannabinoid quốc tế ( Gauson et al. , 2008 ; 2009 ; Cascio et al. , 2009 ).

Phương pháp

Các kết quả

Cannabigerol là chất kích thích mạnh của [ ³⁵ S] GTPγS liên kết với màng não

Trong các thí nghiệm ban đầu của chúng tôi, chúng tôi đã nghiên cứu tác dụng của cannabigerol trên [ ³⁵ S] GTPγS liên kết với màng não chuột MF1. Chúng tôi thấy rằng ở nồng độ trong phạm vi picomole và nano thấp, cannabinoid này tạo ra sự kích thích liên quan đến nồng độ của [ ³⁵ S] GTPγS liên kết với màng não chuột MF1 ( Hình 2 ). Các thí nghiệm được thực hiện với màng não thu được từ chuột CB ₁ ^{+ / +} hoặc CB ₁ ^{– / –} C57BL / 6J cho kết quả tương tự ( Bảng 1 ) và cũng cho thấy, như trong màng não chuột MF1 ( Hình 2 ), cannabigerol ở 1 1 không có tác dụng đáng kể trên [ ³⁵S] Liên kết GTPγS và, ở 10 PhaM, tạo ra hiệu ứng ức chế rõ rệt.

Bảng 1

Cannabigerol kích thích [ ³⁵ S] GTPγS liên kết với màng não thu được từ chuột MF1, CB ₁ ^{+ / +} C57BL / 6J và CB ₁ ^{– / –} C57BL / 6J

Chuột căng

Trung bình EC ₅₀ (95% CL)

Trung bình E _{tối đa} (95% CL)

n

MF1

0,2 nM (0,006 và 9,0 nM)

15,5% (8,5 và 22,5%)

7 đến 20

CB ₁ ^{+ / +} C57BL / 6J

0,04 nM (0,002 và 0,8 nM)

17,0% (10,4 và 23,7%)

số 8

CB ₁ ^{– / –} C57BL / 6J

0,17 nM (0,01 và 2,8 nM)

11,4% (6,6 và 16,2%)

số 8

Giá trị trung bình EC ₅₀ và E _{tối đa} được tính từ dữ liệu thu được với nồng độ cannabigerol lên tới 10 nM.

CL, giới hạn tin cậy.

Hình 2

Tác dụng của cannabigerol trên [ ³⁵ S] GTPγS liên kết với toàn bộ màng não thu được từ chuột MF1 ( n = 7 đến 20). Mỗi biểu tượng đại diện cho phần trăm thay đổi trung bình trong ràng buộc ± SEM. Dấu hoa thị biểu thị các giá trị khác biệt đáng kể so với không (** P <0,01; *** P <0,001; t- test một mẫu ).

Sự ức chế tỷ lệ phần trăm trung bình của liên kết [ ³⁵ S] GTPγS được tìm thấy là 30,1% ± 3,8 ( n = 17) trong màng não chuột MF1 ( Hình 2 ), 14,2% ± 3,4 ( n = 6) trong CB ₁ ^{+ / +} C57BL / Màng não chuột 6J và 21,8% ± 4,6 ( n = 8) trong màng não chuột CB ₁ ^{– / –} C57BL / 6J và mỗi giá trị trung bình này nhỏ hơn không đáng kể ( P <0,01; t- test một mẫu ) . Những kết quả này cho thấy rằng cả tác dụng kích thích cũng như tác dụng ức chế của cannabigerol đối với [ ³⁵ S] GTPγS liên kết với màng não chuột đều qua trung gian thụ thể CB ₁ .

Cư xử như một Cannabigerol α ₂ -adrenoceptor agonist trong chuột bị cô lập ống dẫn tinh

Bằng chứng nữa cho thấy cannabigerol không phải là chất chủ vận thụ thể CB ₁ được lấy từ các thí nghiệm được thực hiện với ống dẫn tinh phân lập chuột. Cụ thể hơn, mặc dù cannabigerol đã chia sẻ khả năng của các chất chủ vận thụ thể cannabinoid được thiết lập như CP55940 và Δ ⁹ -tetrahydrocannabinol ( Pertwee et al. , 1995 ) để tạo ra sự ức chế liên quan đến nồng độ của các cơn co thắt do điện ( Hình 3 ) trong đường cong phản ứng nồng độ log của cannabigerol được tạo ra bởi rimonabant ở mức 100 nM (dữ liệu không được hiển thị), nồng độ bằng hoặc vượt quá nồng độ của chất đối kháng chọn lọc CB _{1 này} đã được tìm thấy trước đây để đối kháng với CB đã thành lập₁ chất chủ vận thụ thể trong sinh học này ( Pertwee et al. , 1995 ; Ross và cộng sự , 2001 ). Cannabigerol ức chế khơi dậy bằng điện co thắt của ống dẫn tinh ở nồng độ dưới bất kỳ tìm thấy để làm giảm bớt phản ứng co bóp hoặc với các thụ thể P2 agonist, β, γ-methylen ATP, hoặc đến α ₁ -adrenoceptor agonist, phenylephrine hydrochloride. Do đó, nó ức chế các cơn co thắt do điện gây ra ở nồng độ 100 nM trở xuống ( Hình 3 ), các phản ứng co bóp bị suy giảm của ống dẫn tinh đến β,-methylene ATP, ở 1 1M nhưng không phải ở 100 nM ( Hình 4) và không ảnh hưởng đến các cơn co thắt do phenylephrine hydrochloride ngay cả ở nồng độ 1 GIỜ ( Hình 4 ). Khi các cơn co thắt được gợi lên bằng điện được cho là kết quả của việc giải phóng ATP và noradrenaline đối với các thụ thể P2 sau chức năng và các thụ thể α ₁ -adrenoceptor (Giới thiệu), những phát hiện này cho thấy cannabigerol có thể ức chế các cơn co thắt này bằng cách tác động trước.

Mở trong một cửa sổ riêng

hinh 4

Các tấm trên: có nghĩa là sự gia tăng sức căng của chuột MF1 bị cô lập vas deferens gây ra bởi β,-methylene ATP với sự hiện diện của DMSO (vòng tròn) hoặc cannabigerol (hình tam giác). Để xây dựng các đường cong phản ứng nồng độ log, β,-methylene ATP lần đầu tiên được thêm 30 phút (A) sau DMSO hoặc 100 nM cannabigerol ( n = 6 hoặc 8) hoặc (B) sau DMSO hoặc 1 néMababol ( n = số 8). Các dấu cho thấy một sự khác biệt đáng kể giữa các phản ứng co đến 10 mM β, γ-methylen ATP trong sự vắng mặt của cannabigerol và phản ứng tương ứng trong sự hiện diện của cannabinoid này ( P <0,05; lẻ t-kiểm tra). Bảng dưới: có nghĩa là sự gia tăng sức căng của chuột bị cô lập vas deferens gây ra bởi 32 PhaM phenylephrine trong trường hợp không có hoặc có 1 canMabigerol. Hai giá trị trung bình không khác nhau đáng kể ( P > 0,05; không ghép đôi t- test). Việc bổ sung phenylephrine được thực hiện 30 phút sau khi DMSO (cột mở) hoặc cannabigerol ( n = 8). Trong tất cả các bảng, mức tăng trung bình của lực căng được biểu thị bằng gam ± SEM. DMSO, dimethyl sulphoxide.

Mở trong một cửa sổ riêng

Hình 3

Đường cong phản ứng nồng độ log trung bình của (A) cannabigerol ( n = 13), (B) clonidine ( n = 7) (C) dexmedetomidine ( n = 5) và (D) maprotiline ( n = 7) ở chuột MF1 được phân lập ống dẫn tinh được xây dựng với sự hiện diện của yohimbine hoặc phương tiện của nó. Mỗi biểu tượng đại diện cho giá trị trung bình ± SEM để ức chế các cơn co thắt gợi lên bằng điện được biểu thị bằng phần trăm biên độ của phản ứng co giật được đo ngay trước khi thêm cannabigerol, clonidine hoặc maprotiline vào bồn tắm nội tạng. Yohimbine hoặc phương tiện của nó đã được thêm 30 phút trước lần bổ sung đầu tiên này và tất cả các lần bổ sung tiếp theo được thực hiện trong khoảng thời gian 5 hoặc 15 phút ( Phương pháp). Mỗi đường cong phản ứng tập trung log được xây dựng tích lũy. Giá trị K _B rõ ràng trung bình của yohimbine với giới hạn tin cậy 95% được hiển thị trong ngoặc là 10,1 nM (3.0 và 33,7 nM) so với cannabigerol, 14,0 nM (4,9 và 40,6 nM) so với clonidine, 8,7 nM (4,3 và 17,8 nM) so với dexmedidine và 8.2 nM (1.5 và 46.0 nM) so với maprotiline. Khi không có yohimbine, các cơn co thắt do điện gây ra đã bị ức chế bởi cannabigerol, clonidine, dexmedetomidine và maprotiline với các giá trị EC ₅₀ trung bình là 72,8 nM (23,4 và 227 nM), 6,3 nM (2,0 và 19,7 nM) ) và 24,9 nM (5,6 và 111,2 nM) tương ứng. Giới hạn tin cậy 95% của các giá trị trung bình này được hiển thị trong ngoặc. E _{tối đa} tương ứng các giá trị lần lượt là 51,7% (44,3 và 59,1%), 63,0% (54,1 và 71,8%), 85,8% (81,6 và 90,0%) và 58,2% (47,1 và 69,3%).

Một khả năng là tác dụng ức chế của cannabigerol đối với các cơn co thắt được gợi lên bằng điện của chuột vas deferens được điều hòa bởi các chất ức chế α ₂ -adrenoceptor vì thường được chấp nhận rằng các thụ thể này làm trung gian ức chế các cơn co thắt như vậy khi được kích hoạt bởi noradrenaline. chất chủ vận ( Pertwee et al. , 2005 ); xem xét lại ( von Kügelgen và Starke, 1991 ; Starke, 2001 ). Để kiểm tra giả thuyết này, chúng tôi đã nghiên cứu xem cannabigerol có thể được đối kháng trong ống dẫn tinh bằng cách chọn lọc _{2 không}thuốc đối kháng -adrenoceptor, yohimbine. Chúng tôi thấy rằng không chỉ yohimbine thực sự có thể đối kháng với sự ức chế cannabigerol gây ra bởi các cơn co thắt do điện gây ra mà còn cả khả năng tạo ra sự đối kháng này tương tự như hiệu lực của nó đối với clonidine và dexmedid ( Hình 3 ). , cả hai đều được thành lập α ₂ agonists -adrenoceptor ( Newman-Tancredi et al. , 1998 ). Yohimbine cũng chống lại sự ức chế các cơn co thắt do điện gây ra bởi các ống dẫn tinh gây ra bởi maprotiline, một chất ức chế hấp thu noradrenaline ( Barbaccia et al. , 1986), với hiệu lực phù hợp với tiềm năng mà nó đối kháng với cannabigerol ( Hình 3 ). Do đó, có vẻ như có khả năng rằng ₂ -adrenoceptor thực sự làm trung gian ức chế cannabigerol gây ra bởi các cơn co thắt gợi lên bằng điện của vas deferens.

Cannabigerol cũng cư xử như một α ₂ -adrenoceptor agonist trong màng não chuột

Các kết quả thu được trong ống dẫn tinh thí nghiệm đưa ra khả năng rằng sự kích thích cannabigerol gây ra của [ ³⁵ S] GTPγS gắn vào màng não chuột ( Hình 2 ) cũng có thể là α ₂ -adrenoceptor trung gian. Để điều tra khả năng này, trước tiên chúng tôi đã thực hiện các thí nghiệm hướng vào việc xác định xem dexmedetomidine có chia sẻ khả năng cannabigerol kích thích [ ³⁵ S] GTPγS liên kết với màng não chuột MF1 hay không. Chúng tôi nhận thấy rằng đây α ₂ -adrenoceptor agonist thực sự có thể gây kích thích như vậy và rằng nó được đối kháng bởi Yohimbine tại 100 nM ( Hình 5 ). Nồng độ yohimbine này cũng đối kháng kích thích cannabigerol gây ra [ ³⁵S] Liên kết GTPγS, dữ liệu thu được cho thấy thiếu bất kỳ sự khác biệt đáng kể nào giữa các giá trị K _B rõ ràng của yohimbine cho sự đối kháng của hai hợp chất này ( Hình 5 ).

Hình 5

Đường cong phản ứng nồng độ log trung bình của (A) dexmedetomidine ( n = 4) và (B) cannabigerol ( n = 12) được xây dựng khi không có hoặc có mặt 100 nM yohimbine. Mỗi biểu tượng đại diện cho phần trăm thay đổi trung bình trong liên kết của [ ³⁵ S] GTPγS với toàn bộ màng não của chuột MF1 ± SEM. Giá trị trung bình EC ₅₀ của dexmedetomidine và cannabigerol khi không có yohimbine với giới hạn tin cậy 95% được hiển thị trong ngoặc lần lượt là 4,3 nM (0,7 và 25,5 nM) và 0,13 nM (0,004 và 4,4 nM). Giá trị trung bình E _{tối đa} tương ứnggiá trị lần lượt là 26,5% (17,1 và 36,0%) và 14,8% (5,9 và 23,7%). Các dịch chuyển bên phải do yohimbine tạo ra trong các đường cong phản ứng nồng độ log của dexmedetomidine và cannabigerol có ý nghĩa và không sai lệch đáng kể so với song song ( P > 0,05). Giá trị K _B rõ ràng trung bình của yohimbine cho sự đối kháng này, với giới hạn tin cậy 95% được hiển thị trong ngoặc là 3,9 nM (1,0 và 15,1 nM) so với dexmedetomidine và 1,8 nM (0,04 và 90,5 nM) so với cannabigerol.

Thụ thể Cannabigerol và cannabinoid

Như cannabigerol là một thành phần cần sa, đó là quan tâm đến điều tra xem liệu nó chia sẻ khả năng của nhà máy cannabinoids Δ ⁹ -tetrahydrocannabinol, Δ ⁹ -tetrahydrocannabivarin và cannabidiol để ràng buộc để cannabinoid CB ₁ và CB ₂ thụ thể (xem Pertwee, 2008 ) . Cannabigerol có thể thay thế hoàn toàn [ ³ H] CP55940 từ các vị trí gắn kết cụ thể cả trong màng não chuột và màng tế bào CHO-hCB ₂ , giá trị K _i trung bình của nó cho sự dịch chuyển này cho thấy nó có CB ₁ lớn hơn ái lực của thụ thể CB ₂ ( Hình 6). Các dữ liệu ràng buộc thu được với màng não cho thấy rằng mặc dù cannabigerol không liên kết với CB cannabinoid ₁ thụ thể, đây chỉ là phát hiện ở nồng độ cao hơn những người ở đó nó kích thích [ ³⁵ S] GTPγS ràng buộc đối với các màng ( Hình 2 và and5).5 ). Do đó, các thí nghiệm tiếp theo đã được thực hiện để xác định xem nồng độ cannabigerol có thể làm giảm rõ ràng sự gắn kết cụ thể của [ ³ H] CP55940 với màng não, cũng là anandamide đối kháng hoặc CP55940.

Hình 6

Sự dịch chuyển của [ ³ H] CP55940 bởi cannabigerol từ các vị trí liên kết cụ thể trên màng tế bào toàn bộ chuột (A) MF1 ( n = 4) và (B) CHO-hCB ₂ màng tế bào ( n = 8). Mỗi biểu tượng đại diện cho phần trăm dịch chuyển trung bình ± SEM. Giá trị K _i trung bình với giới hạn tin cậy 95% được hiển thị trong ngoặc là (A) 381 nM (231 và 627 nM) cho sự dịch chuyển từ màng não và (B) 2.6 NottM (1.4 và 4.7 .MM) cho dịch chuyển từ màng tế bào CHO-hCB ₂ . CHO, chuột đồng Trung Quốc.

Tập đầu tiên của các thí nghiệm này cho thấy rằng sự kích thích anandamide do [ ³⁵ S] GTPγS liên kết với màng não chuột đã được đối kháng đáng kể bởi cannabigerol ở 10 10M ( Hình 7A ). Điều này đã làm với giá trị K _B trung bình rõ ràng ( Bảng 2 ) nhỏ hơn đáng kể so với giá trị K _i trung bình của nó đối với sự dịch chuyển của [ ³ H] CP55940 từ màng não ( Hình 6 ). Tuy nhiên, phù hợp với khả năng tự cannabigerol ức chế [ ³⁵S] GTPγS liên kết với màng não ở 10 PhaM, nó cũng xuất hiện để tạo ra sự dịch chuyển xuống trong đường cong phản ứng nồng độ log của anandamide. Khi thành phần này của thuốc đối kháng cannabigerol có khả năng phát sinh từ khả năng của hợp chất này ức chế liên kết GTPγS [ ³⁵ S] đã bị loại trừ, một sự thay đổi đáng kể về đường cong phản ứng nồng độ log của anandamide vẫn còn rõ ràng ( Hình 7C ). Quan trọng hơn, giá trị K _B rõ ràng trung bình được tính từ sự dịch chuyển này ( Bảng 2 ) không khác biệt đáng kể so với giá trị K _i trung bình của cannabigerol đối với sự dịch chuyển của [ ³ H] CP55940 từ màng não ( Hình 6). Ngoài ra, vì sự thay đổi bên phải này không đi lệch đáng kể so với song song, có khả năng cannabigerol là một chất đối kháng cạnh tranh của anandamide. Không phải dịch chuyển bên phải hay dịch chuyển xuống trong đường cong phản ứng nồng độ log để kích thích anandamide do [ ³⁵ S] GTPγS liên kết với màng não chuột MF1 được tạo ra bởi cannabigerol ở 1 1MM ( n = 6; dữ liệu không được hiển thị) .

ban 2

Giá trị K _B rõ ràng trung bình của cannabigerol đối với sự đối kháng của kích thích anandamide- và CP55940 của [ ³⁵ S] GTPγS liên kết với màng não chuột MF1

Chất chủ vận

Nhân vật phản diện (10 tuổi)

K _B rõ ràng (95% CL)

K _B rõ ràng (95% CL) ¹

n

Anandamid

Cần sa

33,1 nM (13,2 và 82,9 nM)

483 nM (162 và 1445 nM)

5

CP55940

Cần sa

53,7 nM (19,4 và 149 nM)

936 nM (336 và 2606 nM)

6

^{1 Được} tính sau khi trừ đi hiệu ứng ức chế trung bình gây ra bởi 10 phaM cannabigerol trên liên kết GTPγS [ ³⁵ S] trong trường hợp không có bất kỳ hợp chất nào khác (30,1%; chú thích Hình 7 ).

CL, giới hạn tin cậy.

Mở trong một cửa sổ riêng

Hình 7

Các tấm trên: tác dụng của 10 phaM cannabigerol (CBG) trên đường cong phản ứng nồng độ log trung bình của (A) anandamide và (B) CP55940 để kích thích [ ³⁵ S] GTPγS liên kết với màng não chuột. Các bảng dưới: tác dụng của 10 PhaM cannabigerol (CBG) trên đường cong phản ứng nồng độ log trung bình của (C) anandamide và (D) CP55940 để kích thích liên kết [ ³⁵ S] GTPγS sau khi trừ hiệu ứng ức chế gây ra bởi 10 canMabigerol trên [ ³⁵ S] Liên kết GTPγS khi không có bất kỳ hợp chất nào khác (30,1 ± 3,8%; n = 17; Hình 2 ). Giá trị này được trừ vào tất cả các giá trị kích thích phần trăm của [ ³⁵S] GTPγS liên kết bằng anandamide hoặc CP55490 được xác định với sự hiện diện của cannabigerol. Các thí nghiệm đã được thực hiện với màng não toàn bộ chuột MF1 và kích thích liên kết [ ³⁵ S] GTPγS được biểu thị bằng phần trăm kích thích trung bình ± SEM ( n = 5 hoặc 6). Các dịch chuyển bên phải được sản xuất bởi cannabigerol trong các đường cong phản ứng nồng độ log của anandamide và CP55940 không sai lệch đáng kể so với song song ( P > 0,05). DMSO, dimethyl sulphoxide.

Ngoài ra, 10 kích thích cannabigerol đối kháng kích thích CP55940 do [ ³⁵ S] GTPγS liên kết với màng não chuột ( Hình 7B ). Một lần nữa, cannabigerol xuất hiện để tạo ra cả một bên phải và một sự thay đổi đi xuống trong đường cong phản ứng tập trung log của chất chủ vận. Sau khi bù cho sự dịch chuyển xuống ( Hình 7D ), người ta thấy rằng giá trị K _B rõ ràng của cannabigerol đối với sự đối kháng của CP55940 ( Bảng 2 ) không khác biệt đáng kể so với giá trị K _B trung bình của cannabigerol đối với anandamide hoặc đối kháng giá trị trung bình K _i của cannabigerol cho sự dịch chuyển của [ ³H] CP55940 từ màng não ( Hình 6 ). Như trong các thí nghiệm anandamide, dịch chuyển phường phải do cannabigerol gây ra trong đường cong phản ứng nồng độ log của CP55940 ( Hình 7D ) không sai lệch đáng kể so với song song. Kết hợp lại với nhau, những phát hiện này ủng hộ cho giả thuyết cannabigerol là chất đối kháng cạnh tranh thụ thể CB ₁ , mặc dù có hiệu lực thấp hơn nhiều so với rimonabant ( Thomas et al. , 2007 ).

Cannabigerol và 5HT _1A thụ

Có bằng chứng cho thấy một số phối tử α ₂ -adrenoceptor đã thành lập , bao gồm clonidine và yohimbine, nhắm vào các thụ thể 5-HT _1A ở nồng độ trên những nồng độ mà chúng kích hoạt hoặc ngăn chặn α ₂ -adrenoceptor ( Newman-Tancredi et al. , 1998 ). Điều này đã thôi thúc chúng tôi điều tra xem liệu cannabigerol có tương tác với các thụ thể 5-HT _1A ở nồng độ cao hơn nồng độ mà nó kích thích [ ³⁵ S] GTPγS liên kết với màng não chuột MF1 hay không.

Các thí nghiệm ban đầu đã xác nhận rằng chất đối kháng chọn lọc 5-HT _1A , WAY100635 ( Forster et al. , 1995 ), đã đối kháng với tác dụng kích thích của 8-OH-DPAT, chất chủ vận thụ thể 5-HT _1A ( Forster et al. , 1995 ) , trên [ ³⁵ S] GTPγS liên kết với màng não ( Hình 8 ). Giá trị K _B rõ ràng trung bình của WAY100635 cho sự đối kháng này là 1 nM. Các thí nghiệm tiếp theo cho thấy, tại 1 LờiM, cannabigerol cũng đối kháng 8-OH-DPAT trong sinh học này như được chỉ ra bởi khả năng của cannabigerol tạo ra sự dịch chuyển song song bên phải trong đường cong phản ứng nồng độ log của 5-HT _{1A này}chất chủ vận chọn lọc ( Hình 8B ). Dữ liệu từ thí nghiệm này và từ các thí nghiệm tương tự được thực hiện với 10 ThayM cannabigerol ( Hình 8C ) hoặc với một hoặc ba nồng độ cannabigerol thấp hơn (dữ liệu không hiển thị) cho phép xây dựng một sơ đồ Schild ( Hình 8D ), độ dốc của không khác biệt đáng kể so với sự thống nhất. Giá trị K _B rõ ràng trung bình của cannabigerol cho tính đối kháng của 8-OH-DPAT, theo tính toán từ lô Schild này, là 51,9 nM.

Mở trong một cửa sổ riêng

Hình 8

Đường cong phản ứng nồng độ log trung bình của R – (+) – 8-hydroxy-2- (di- n -propylamino) tetralin (8-OH-DPAT) được xây dựng với sự có mặt của (A) DMSO hoặc 100 nM WAY100635 ( n = 7), (B) DMSO hoặc 1 PhaM cannabigerol ( n = 10) hoặc (C) DMSO hoặc 10 KhănM cannabigerol ( n = 12). Mỗi biểu tượng đại diện cho phần trăm thay đổi trung bình trong liên kết của [ ³⁵ S] GTPγS với toàn bộ màng não của chuột MF1 ± SEM. Không phải dịch chuyển phường phải do WAY100635 tạo ra trong đường cong phản ứng nồng độ log của 8-OH-DPAT cũng không phải do 1 hoặc 10 10MM cannabigerol tạo ra làm lệch đáng kể so với song song ( P > 0,05). K _B rõ ràng trung bìnhcác giá trị với giới hạn tin cậy 95% được hiển thị trong ngoặc là (A) 1,0 nM (0,5 và 2,3 nM) cho WAY100635, (B) 19,6 nM (6,9 và 55,8 nM) cho 1 1MM cannabigerol và (C) 28,2 nM (7,7 và 102,9 nM ) cho 10 ĐÁM cannabigerol. Bảng điều khiển (D): Sơ đồ Schild cho sự đối kháng của 8-OH-DPAT bằng 100 nM, 316 nM, 1 TiếtM, 3.16 TiếtM và 10 HộpM cannabigerol ( n = 5 đến 12) với dải tin cậy 99% được hiển thị bằng các đường chấm. Độ dốc trung bình của đường phù hợp nhất này với giới hạn tin cậy 95% được hiển thị trong ngoặc là 1.1 (1.0 và 1.2) và do đó không khác biệt đáng kể so với thống nhất. Giá trị K _B rõ ràng trung bình của cannabigerol được tính toán từ biểu đồ Schild này, với giới hạn tin cậy 95% được hiển thị trong ngoặc, là 51,9 nM (37,6 và 68,2 nM). DMSO, dimethyl sulphoxide.

Cannabigerol (1 PhaM) không kém hiệu quả trong việc tạo ra sự dịch chuyển song song bên phải trong đường cong phản ứng nồng độ log của 8-OH-DPAT để kích thích [ ³⁵ S] GTPγS liên kết với màng não khi các màng này được lấy từ CB ₁ ^{+ / +} hoặc chuột CB ₁ ^{– / –} C57BL / 6J (dữ liệu không được hiển thị) thay vì từ chuột MF1. Giá trị K _B rõ ràng trung bình của cannabigerol với giới hạn tin cậy 95% được hiển thị trong ngoặc là 19,6 nM (6,9 và 55,8; n = 10; Hình 8B ) khi được tính từ dữ liệu thu được bằng màng não chuột MF1 và 6,2 nM (2,6 và 14,8 nM ; n = 11) và 2,3 nM (0,7 và 7,7 nM; n= 13) tương ứng khi được tính toán từ dữ liệu màng não chuột CB ₁ ^{+ / +} và CB ₁ ^{– / –} C57BL / 6J.

Thảo luận

Kết quả từ các thí nghiệm ban đầu của chúng tôi chỉ ra rằng cannabigerol thể hiện tiềm năng đáng kể cả khi là chất kích thích của [ ³⁵ S] GTPγS liên kết với màng não chuột ( Hình 2 ) và như một chất ức chế các cơn co thắt được gợi lên bằng điện của chuột bị cô lập vas deferens ( Hình 3 ). Cả hai tác dụng này dường như không qua trung gian bởi thụ thể CB ₁ cannabinoid . Do đó, cannabigerol thể hiện không ít tiềm năng hoặc hiệu quả như một chất kích thích [ ³⁵ S] GTPγS liên kết với màng não chuột CB ₁ ^{– / –} so với màng não chuột CB ₁ ^{+ / +} và tác dụng ức chế của nó đối với các cơn co thắt do điện gây ra không bị đối kháng bởi CB₁ -selective chất đối kháng, rimonabant, khi điều này được thực hiện tại 100 nM, nồng độ cao hơn cần thiết để vô hiệu hóa sự chủ vận thụ thể cannabinoid thành lập, CP55940, R – (+) – WIN55212 và Δ ⁹ -tetrahydrocannabinol, trong xét nghiệm sinh học tương tự ( Pertwee et al. , 1995 ; Ross và cộng sự , 2001 ). Vì những lý do chưa được thiết lập, chỉ trong phạm vi nồng độ rất thấp mà cannabigerol tạo ra sự gia tăng liên quan đến nồng độ trong [ ³⁵ S] GTPγS liên kết với CB ₁ ^{+ / +} hoặc CB ₁ ^{– / –}màng não chuột. Do đó, trong phạm vi nồng độ 0,01 nM đến 1 PhaM, đường cong phản ứng nồng độ log của nó có dạng hình chuông và thực tế, ở 10 daoM, cannabigerol bị ức chế rõ rệt [ ³⁵ S] GTPγS liên kết với màng não.

Nó không chắc rằng cannabigerol ức chế co thắt khơi dậy bằng điện của ống dẫn tinh bằng cách tác động postjunctionally để chặn những hành động của hai dẫn truyền thần kinh được cho là gây ra những co thắt: ATP tác động lên các thụ thể P2X sau khớp thần kinh và diễn xuất noradrenaline trên α sau khớp thần kinh ₁ -adrenoceptors ( von Kügelgen và Starke, 1991 ; Trendelenburg và cộng sự , 2000 ). Do đó, cannabigerol bị ức chế các cơn co thắt gợi lên bằng điện ở nồng độ mà tại đó nó không ảnh hưởng đáng kể đến biên độ của các cơn co thắt gây ra bởi các chất chủ vận P2X, β,-methylene-ATP, hoặc bởi ₁thuốc chủ vận -adrenoceptor, phenylephrine. Cannabigerol, do đó, khác với cannabinoid thực vật khác, Δ ⁹ -tetrahydrocannabivarin, trong vas deferens của chuột MF1 làm giảm biên độ của các cơn co thắt do 10 10MM β,-methylene-ATP hoặc 32. về nồng độ mà nó ức chế các cơn co thắt gợi lên bằng điện của mô này ( Thomas và cộng sự , 2005 ). Nồng độ,-methylene-ATP và phenylephrine được sử dụng trong các thí nghiệm trước đây với Δ ⁹ -tetrahydrocannabivarin giống như được sử dụng trong các thí nghiệm cannabigerol của chúng tôi.

Kết quả thu được với chọn lọc α ₂ -adrenoceptor chất đối kháng, Yohimbine, gợi ý rằng cả hai tác dụng ức chế của cannabigerol trên co thắt khơi dậy bằng điện của ống dẫn tinh và tác động kích thích của nó trên [ ³⁵ S] GTPγS gắn vào màng não chuột được trung gian bởi α ₂ – adrenoceptors. Như vậy, Yohimbine đối kháng cả những ảnh hưởng của cannabigerol ở nồng độ (100 nM) mà tại đó nó được dự kiến sẽ hiển thị chọn lọc như một α ₂ -adrenoceptor chất đối kháng ( Newman-Tancredi et al. , 1998 ). Hơn nữa, K _B rõ ràng trung bìnhcác giá trị của yohimbine cho sự đối kháng này trong ống dẫn tinh và màng não (tương ứng 10,1 và 1,8 nM) không khác biệt đáng kể với nhau (Kết quả) hoặc từ giá trị K _i được báo cáo trước đó (5,8 nM) cho liên kết của nó với con người α _2A -adrenoceptors ( Newman-Tancredi et al. , 1998 ). Giả thuyết cho rằng cannabigerol có thể kích hoạt α ₂ -adrenoceptors cũng được hỗ trợ bởi dữ liệu thu được với yohimbine và hai α ₂ chọn lọcthuốc chủ vận -adrenoceptor, dexmedetomidine và clonidine. Những dữ liệu này cho thấy Yohimbine sở hữu tiềm năng tương tự như một nhân vật phản diện của cannabigerol-, dexmedetomidine- và clonidin gây ra sự ức chế co thắt khơi dậy bằng điện của ống dẫn tinh ( Hình 3 ) và là một nhân vật phản diện của cannabigerol và dexmedetomidine, trong [ ³⁵ S] GTPγS xét nghiệm ràng buộc ( Hình 5 ). Các bằng chứng cho thấy mục tiêu cannabigerol một trang web prejunctional để ức chế co thắt khơi dậy bằng điện của ống dẫn tinh (xem đoạn trước) và α prejunctional ₂ -adrenoceptors thể làm trung gian co thắt như cho vay hỗ trợ thêm cho giả thuyết rằng cannabigerol có thể kích hoạt α ₂-adrenoceptors. Trước tiên, các thí nghiệm bổ sung được yêu cầu trước tiên để xác định xem tác dụng ức chế của cannabigerol trong ống dẫn tinh và tác dụng kích thích của nó trong xét nghiệm gắn kết GTPγS [ ³⁵ S] có qua trung gian bởi α _2A -, α _2B – và / hoặc α _2C -adrenoceptors, và thứ hai để điều tra lý do tại sao những tiềm năng mà màn hình cannabigerol trong hai sinh trắc nghiệm này là rất khác nhau ( Bảng 1 và Hình 2 và and3).3 ). Trong khi đó, đáng chú ý là có bằng chứng cho thấy noradrenaline được kích thích bằng điện từ các ống dẫn tinh có thể bị ức chế bởi sự kích hoạt không chỉ của α _2A-adrenoceptors mà còn của α _2C -adrenoceptors ( Scheibner et al. , 2001 ), đặc biệt là khi tần số của kích thích điện là tương đối thấp như nó đã được trong cuộc điều tra này.

Cũng cần có thêm các thí nghiệm hướng vào việc xác định xem cannabigerol có chia sẻ khả năng của hai loại cannabinoids thực vật khác, Δ ⁹ -tetrahydrocannabinol và cannabidiol, để ức chế sự hấp thu tế bào thần kinh của noradrenaline (xem Pertwee, 2008 ). Do đó, các thí nghiệm của chúng tôi cho thấy đầu tiên rằng chất ức chế hấp thu noradrenaline, maprotiline, có thể ức chế các cơn co thắt gợi lên bằng điện của chuột bị cô lập vas deferens, và thứ hai là yohimbine đối kháng cannabigerol và maprotiline trong sinh học này. Do đó, vẫn có thể cannabigerol ức chế phản ứng co giật của ống dẫn tinh ít nhất một phần bằng cách ngăn chặn sự tái hấp thu noradrenaline được giải phóng theo cách khiến catecholamine này tích tụ ở giai đoạn trước ₂-adrenoceptors và do đó ức chế cả phát hành gợi lên của nó và ATP. Nếu cannabigerol thực sự có thể ức chế tái hấp thu noradrenaline, điều này sẽ phù hợp với một báo cáo sơ bộ rằng nó làm tăng hành vi vật lộn trong thử nghiệm huyền phù đuôi chuột, một dấu hiệu cho thấy nó có thể có hoạt tính chống trầm cảm ( Musty và Deyo, 2006 ). Mặc dù điều quan trọng là cannabigerol không thể hoạt động theo cách này để kích thích [ ³⁵ S] GTPγS liên kết với màng não chuột mà chúng tôi đã sử dụng trong cuộc điều tra này, cho thấy khả năng nó có thể là một tác nhân trực tiếp mạnh mẽ ₂chất chủ vận -adrenoceptor và một chất ức chế tái hấp thu noradrenaline. Một điều đáng chú ý là ít có khả năng bất kỳ sự gia tăng nồng độ noradrenaline ngoại bào nào gây ra do ức chế sự hấp thu tế bào thần kinh của nó sẽ tạo ra sự gia tăng trung gian của α ₁ -adrenoceptor đối với các cơn co thắt do điện gây ra. Như vậy, có bằng chứng cho thấy trong điều kiện kích thích được sử dụng trong cuộc điều tra này, biên độ co bóp của ống dẫn tinh được xác định nhiều hơn bằng cách kích hoạt ATP-induced của purinoceptors P2X sau khớp thần kinh hơn bởi kích hoạt noradrenaline gây ra của sau khớp thần kinh α ₁ -adrenoceptors ( Pertwee et al. , 2002 ).

Trong khi đó cannabigerol được tìm thấy cho thấy hiệu lực và hiệu quả thấp hơn đáng kể so với dexmedetomidine vì là chất ức chế các cơn co thắt gợi lên bằng điện của ống dẫn tinh ( Hình 3 ), trong thử nghiệm gắn kết GTPγS [ ³⁵ S] trong đó cả hai hợp chất đều có hiệu lực cao (khá thấp) Hình 5 ), không có sự khác biệt nào được phát hiện. Tại sao điều này vẫn nên được thiết lập, có thể giải thích rằng các phân nhóm α ₂ -adrenoceptor khác nhau, hoặc các loại thụ thể khác nhau, làm trung gian tác dụng của cannabigerol trong não và vas deferens và / hoặc, như vừa thảo luận, đó là sự ức chế tái hấp thu noradrenaline có thể đóng một phần quan trọng trong ức chế cannabigerol gây ra các cơn co thắt gợi lên của ống dẫn tinh.

Sự kích thích [ ³⁵ S] GTPγS liên kết với màng não chuột được sản xuất bởi nồng độ cannabigerol trong phạm vi nano thấp không xuất hiện qua trung gian thụ thể cannabinoid CB ₁ . Tuy nhiên, bằng chứng đã thu được rằng ở nồng độ cao hơn, phytocannabinoid này có thể nhắm mục tiêu thụ thể CB ₁ như một chất đối kháng. Do đó, trong các thí nghiệm được thực hiện với màng não chuột MF1, cannabigerol đã được tìm thấy để làm giảm sự gắn kết cụ thể của [ ³ H] CP55940 với màng não chuột MF1 ( K _i = 381 nM) và, ở 10 10M, để đối kháng với chất chủ vận thụ thể cannabinoid, anandamide và CP55940, trong [ ³⁵S] Xét nghiệm ràng buộc GTPγS. Không có sự đối kháng đáng kể của anandamide được gây ra bởi 1 canMabigerol.

Mặc dù tác dụng của cannabigerol trên [ ³⁵ S] GTPγS liên kết với màng não chuột MF1 có tác dụng kích thích ở mức 1, 10 và 100 nM, nhưng nó được phát hiện là không đáng kể ở 1 1M và ức chế ở 10 10M. Tại sao tác dụng kích thích của cannabigerol trên [ ³⁵ S] GTPγS liên kết với màng não biến mất và sau đó chuyển sang tác dụng ức chế khi nồng độ của nó tăng dần vẫn được thiết lập. Tuy nhiên, dường như không có sự mất phụ thuộc nồng độ nào vào tác dụng kích thích của cannabigerol cũng như tác dụng ức chế mà nó tạo ra ở 10 10MM là qua trung gian thụ thể CB ₁ , vì cả hai tác dụng cũng có thể phát hiện được trong CB ₁ ^{– / –}Màng não chuột C57BL / 6J. Hiệu ứng ức chế được tạo ra bởi 10PM cannabigerol có lẽ giải thích tại sao nồng độ của phytocannabinoid này dường như tạo ra sự đi xuống cũng như dịch chuyển bên phải trong các đường cong phản ứng nồng độ log của anandamide và CP55940. Khi thành phần của chất đối kháng cannabigerol dường như phát sinh từ khả năng ức chế [ ³⁵ S] GTPγS liên kết với màng não chuột MF1 theo cách thức độc lập với thụ thể CB ₁ đã bị loại trừ, sự thay đổi bên phải của thụ thể CB ₁ đường cong của anandamide và CP55940 vẫn còn rõ ràng ( Hình 8 ). Điều quan trọng là K _B rõ ràngcác giá trị được tính toán từ các dịch chuyển dextral này không khác biệt đáng kể so với giá trị trung bình K _i của cannabigerol đối với sự dịch chuyển của nó [ ³ H] CP55940 sang màng não chuột MF1, hỗ trợ thêm cho giả thuyết rằng cannabigerol là chất đối kháng thụ thể CB ₁ . Cannabigerol làm giảm liên kết cụ thể của [ ³ H] CP55940 không chỉ với màng não mà còn với màng thu được từ các tế bào CHO được truyền với thụ thể CB _{2 của người} . Nó đã làm điều này theo cách cho thấy nó sở hữu ít ái lực với CB ₂ hơn các thụ thể CB ₁ . Các thí nghiệm tiếp theo được yêu cầu để xác định xem cannabigerol có phải là CB _{2 không} chất chủ vận thụ thể hoặc chất đối kháng.

Cannabigerol cũng được tìm thấy để đối kháng với chất chủ vận chọn lọc 5-HT _1A , R – (+) – 8-hydroxy-2- (di- n -propylamino) tetralin (8-OH-DPAT), trong liên kết GTPγS [ ³⁵ S] khảo nghiệm một cách có vẻ cạnh tranh. Điều này có thể làm ở nồng độ cao hơn nồng độ mà nó gây ra sự kích thích qua trung gian α ₂ -adrenoceptor rõ ràng của [ ³⁵ S] GTPγS liên kết với màng não chuột nhưng dưới nồng độ mà nó tạo ra sự đối kháng có thể phát hiện được của anandamide và CP55940 trong sinh học này. Do đó Cannabigerol giống với các chất chủ vận chọn lọc ₂ -adrenoceptor chọn lọc , clonidine và dexmedetomidine, cả hai đều nhắm mục tiêu 5-HT _1Athụ thể ở nồng độ trên những người mà họ kích hoạt α ₂ -adrenoceptors. Tuy nhiên, nó khác với hai hợp chất khác trong việc ngăn chặn hơn là kích hoạt thụ thể 5-HT _1A ( Newman-Tancredi et al. , 1998 ). Sự đối kháng của 8-OH-DPAT gây ra bởi cannabigerol có lẽ không phụ thuộc vào thụ thể CB ₁ vì nó được tạo ra với hiệu lực tương tự trong các thí nghiệm được thực hiện với màng não chuột CB ₁ ^{– / –} C57BL / 6J, như trong các thí nghiệm được thực hiện với CB ₁ ^{+ / +}Màng não chuột C57BL / 6J. Điều thú vị là, trái ngược với tác dụng của nó đối với các đường cong phản ứng nồng độ log của anandamide và CP55940, cannabigerol không thể tạo ra sự dịch chuyển xuống có thể phát hiện được của đường cong phản ứng nồng độ log 8-OH-DPAT khi nó được sử dụng ở nồng độ (10 cáchM) điều đó tự nó đã tạo ra sự ức chế rõ rệt của [ ³⁵ S] GTPγS liên kết với màng não. Lý do cho sự khác biệt này vẫn được thiết lập. Tuy nhiên, sự vắng mặt của bất kỳ sự dịch chuyển xuống như vậy cho thấy cannabigerol là một chất đối kháng thụ thể 5-HT _1A trung tính không tương tác với thụ thể này như một chất chủ vận đảo ngược.

Tóm lại, chúng tôi đã thu được bằng chứng từ in vitro thí nghiệm cannabigerol là một mạnh α ₂ -adrenoceptor agonist. Điều này thật bất ngờ vì cấu trúc của cây cannabinoid này không giống với bất kỳ phối tử α ₂ -adrenoceptor đã được thiết lập nào và vì không có cannabinoid nào khác được báo cáo là hành xử theo cách này. Chúng tôi cũng đã thu được bằng chứng rằng cannabigerol có thể chặn thụ thể 5-HT _1A và cannabinoid CB ₁ mặc dù có hiệu lực thấp hơn so với nó có vẻ như kích hoạt α ₂ -adrenoceptor. Các thí nghiệm tiếp theo hiện đang được yêu cầu để điều tra xem cannabigerol có nhắm vào bất kỳ phân nhóm cụ thể nào của α _{2 không}-adrenoceptor và liệu nó có ức chế sự hấp thu tế bào thần kinh của noradrenaline. Nó cũng sẽ rất quan trọng để thiết lập đầu tiên cho dù cannabigerol sở hữu tiềm năng cao và hiệu quả đáng kể như một α ₂ -adrenoceptor agonist khi dùng in vivo , và thứ hai cho dù nó sẽ hiển thị tiềm năng đáng kể trong cơ thể như một 5-HT _1A chất đối kháng thụ. Nó sẽ là mối quan tâm cũng như để xác minh xem cannabigerol có thể chặn CB ₁ thụ thể in vivo , mặc dù đã có bằng chứng từ các thí nghiệm với khỉ nâu rằng ở một liều ít nhất (16,5 mg · kg ^-1 iv) cannabigerol không làm thay đổi khả năng của Δ ⁹ -THC để tạo ra in vivocác hiệu ứng có lẽ là qua trung gian thụ thể CB ₁ ( Mechoulam et al. , 1970 ). Ngoài ra, sẽ rất quan tâm để điều tra xem liệu cannabigerol có khả năng kích hoạt α ₂ -adrenoceptors in vivo không còn có thể phát hiện được ở liều cao hơn khi xảy ra trong ống nghiệm . Điều cũng quan trọng là xác định hành động dược lý nào của cannabigerol chịu trách nhiệm cho khả năng được báo cáo của nó để tăng hành vi vật lộn trong thử nghiệm đình chỉ đuôi chuột ( Musty và Deyo, 2006 ) hoặc để ức chế sự tăng sinh keratinocyte ở người ( Wilkinson và Williamson, 2007), vì những tác dụng này chỉ ra rằng cannabigerol có thể có tiềm năng điều trị như một thuốc chống trầm cảm và / hoặc để điều trị bệnh vẩy nến. Khả năng cannabigerol có các ứng dụng lâm sàng khác, ví dụ như việc sản xuất thuốc giảm đau qua trung gian α ₂ -adrenoceptor ( Tryba và Gehling, 2002 ; Giovannoni et al. , 2009 ), cũng đáng để điều tra.

Sự nhìn nhận

Bảng chú giải

Người giới thiệu