Paclitaxel là một diterpenoid ba vòng có nguồn gốc tự nhiên với hoạt tính chống ung thư mạnh chống lại tất cả các loại ung thư, đặc biệt là phổi, vú, cổ tử cung, tuyến tiền liệt, đại trực tràng, dạ dày, buồng trứng, xương và khối u não^1,2. Tuy nhiên, ứng dụng lâm sàng của dạng tự nhiên của nó đã bị hạn chế bởi các đặc tính hóa lý của nó như độ hòa tan trong nước thấp, tính thấm kém và dòng chảy p-gp³. Cấu trúc paclitaxel thiếu các nhóm chức có thể được sử dụng để biến đổi hóa học để cải thiện các đặc tính của nó. Điều này đòi hỏi phải tìm kiếm một cách tiếp cận phù hợp để cải thiện các đặc tính hóa lý của paclitaxel và do đó, hiệu quả chống ung thư. Mặc dù các cách tiếp cận khác nhau như sử dụng đồng dung môi hoặc chất hoạt động bề mặt đã được báo cáo để cải thiện các đặc tính hóa lý và dược lý của paclitaxel⁴. Những điều này có liên quan đến tác dụng phụ hoặc độc tính toàn thân. Cụ thể hơn, Cremophor EL: ethanol (hỗn hợp 50:50) đã được sử dụng như một hệ thống đồng dung môi để bào chế (Taxol hoặc các chất tương đương chung) để tiêm tĩnh mạch⁵. Mặc dù ý tưởng này phù hợp để khắc phục khả năng hòa tan hạn chế của paclitaxel, nhưng nó có liên quan đến các độc tính như tăng lipid máu, kết tụ hồng cầu, quá mẫn, bệnh thần kinh cảm giác và giảm bạch cầu trung tính. Chất hoạt động bề mặt như Tween-80 cũng đã được sử dụng để cải thiện khả năng hòa tan của thuốc nhưng có liên quan đến quá mẫn, bệnh thần kinh ngoại biên và hoạt động tán máu⁶. Do đó, có một yêu cầu cấp thiết về một chiến lược xen kẽ không chỉ tăng cường các đặc tính hóa lý và hiệu quả trong cơ thể của thuốc mà còn tránh các độc tính nghiêm trọng và hạn chế liều lượng.

Gần đây, các tinh thể nano thuốc đã nổi lên như một chất mang nano mạnh với kích thước nhỏ hơn, tải thuốc cao và độ ổn định cấu trúc cao hơn^7,8,9. Các tinh thể nano do kích thước của chúng có thể mang lại hiệu quả chống khối u tốt hơn thông qua tăng cường thẩm thấu và lưu giữ ở vùng lân cận của khối u. Các tinh thể nano có thể được tiêm tĩnh mạch để phân phối thuốc đến tế bào ung thư. Tuy nhiên, các tinh thể nano có thể giải phóng thuốc nhanh chóng trong tuần hoàn toàn thân do tốc độ hòa tan cao hơn, như được dự đoán bởi các nguyên tắc Ostwald-Freundlich và Noyes-Whitney¹⁰. Điều này có thể dẫn đến việc phân phối thuốc ngoài mục tiêu đến tất cả các cơ quan chính. Do đó, để kiểm soát sự giải phóng thuốc, kéo dài tuần hoàn toàn thân và xác định phân phối thuốc, cần phải sửa đổi bề mặt của các tinh thể nano. Các tinh thể nano thường được ổn định bằng cách sử dụng polyme hoặc chất hoạt động bề mặt hấp phụ trên bề mặt tinh thể nano để cung cấp sự ổn định thông qua cản trở steric hoặc tĩnh điện¹¹. Bên cạnh đó, protein và lipid cũng đã được khám phá để ổn định tinh thể nano^12,13. Tinh thể nano có thể được phủ bề mặt bằng vật liệu lipid để cải thiện độ ổn định và kéo dài tuần hoàn toàn thân¹⁴. Các tinh thể nano phủ lipid có thể được sử dụng thêm để có được vỏ chức năng phối tử với lõi NC cung cấp lợi thế kết hợp về tải trọng cao, độ ổn định tốt và phân phối chọn lọc đến vị trí đích, do đó tránh phân bố ngoài mục tiêu và giảm thiểu tác dụng phụ toàn thân liên quan đến thuốc chống ung thư.

Mục đích của công việc hiện tại là xây dựng các tinh thể nano phủ lipid để cải thiện việc cung cấp paclitaxel (PTX) (Hình minh họa trong Hình S1 của tệp bổ sung). Đầu tiên, các NC được chuẩn bị bằng cách sử dụng Soluplus làm chất ổn định. Soluplus là một polyme lưỡng tính có khả năng tăng cường độ hòa tan có thể được sử dụng để điều chế các tinh thể nano thuốc có bề mặt ưa nước. Các tinh thể nano đã chuẩn bị sau đó được biến đổi bề mặt bằng vật liệu lipid bao gồm phosphatidylcholine đậu nành hydro hóa (HSPC), Chol và TPGS. HSPC là phospholipid được sử dụng để phủ lên bề mặt ưa nước của các tinh thể nano, Chol ổn định lớp phủ lipid trong khi TPGS cung cấp một lớp tàng hình, cùng chịu trách nhiệm kéo dài tuần hoàn toàn thân. Ngoài ra, TPGS cung cấp khả năng ức chế p-glycoprotein (bơm dịch tiết) và do đó có thể tránh sự xuất hiện của kháng đa thuốc (MDR) trong các tế bào khối u. Các tinh thể nano Lipid được chức năng hóa bề mặt với phần nhắm mục tiêu để xác định việc phân phối thuốc đến tế bào ung thư. Cetuximab được sử dụng để chức năng hóa bề mặt hỗ trợ phân phối mục tiêu thông qua nội bào qua trung gian thụ thể.

Vật liệu

Paclitaxel (USP, 98–100%) được lấy làm mẫu quà tặng từ MSN Laboratories Pvt. Ltd., Telangana, Ấn Độ. Mẫu quà tặng của Soluplus đã được nhận từ BASF, Ấn Độ. Hydrogenated Soyphosphatidylcholine (HSPC) là mẫu quà tặng thu được từ Lipoid, GmBH. Vitamin E-TPGS là mẫu miễn phí do Antares Health Products, St. Charles, Hoa Kỳ tặng. Cholesterol siêu tinh khiết AR, 99% (Chol), Succinic anhydride (SA), 1- (3-Dimethylaminopropyl) −3-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) và N, 4-Dimethylaminopyridine (DMAP) được mua từ SRL Pvt. Ltd., Ấn Độ. Tất cả các dung môi được sử dụng đều là loại HPLC.

Dòng tế bào A549, có nguồn gốc từ ung thư biểu mô phổi được mua từ Trung tâm Khoa học Tế bào Quốc gia (NCCS) nằm ở Pune, Ấn Độ. Genetics Biotech Asia Pvt. Ltd. đã cung cấp các vật liệu phòng thí nghiệm cần thiết, chẳng hạn như DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) và đĩa nuôi cấy tế bào 12 giếng. Việc mua sắm bình T-25 và đĩa 96 giếng do Eppendorf thực hiện. Penicillin-streptomycin, Trypsin-EDTA và Huyết thanh bò thai nhi (FBS) được cung cấp bởi Gibco, New York. Hoechst 33342 được mua từ Realgene, Ý. Nước muối đệm phốt phát (PBS) chất lượng cao, MTT, RNase và propidium iodide được lấy từ SRL, Ấn Độ. Thuốc nhuộm JC-1 được mua từ Cayman Chemical, Hoa Kỳ.

Chuẩn bị lipid-tinh thể nano của paclitaxel

Việc chuẩn bị các tinh thể nano lipid được thực hiện trong ba bước, tức là a) chuẩn bị các tinh thể nano polyme, b) hình thành màng lipid và c) bù nước màng lipid bằng các tinh thể nano. Các tinh thể nano của thuốc đầu tiên được điều chế bằng phương pháp kết tủa chống dung môi đồng thời và kết tinh lạnh, sau đó là siêu âm đầu dò. Soluplus (1% w / v) được sử dụng để ổn định các tinh thể nano paclitaxel (PTX-NC). Pha hữu cơ của etanol (1 ml) có chứa thuốc (20 mg) được thêm nhỏ vào 1% (w / v) dung dịch Soluplus nước (10 ml) bằng cách sử dụng 1 ml ống tiêm (24 kim gạc), duy trì ở tốc độ 2000 vòng / phút trên nước lạnh, sử dụng máy khuấy từ tính (C-MAG HS 7, IKA India Private Limited). Sau đó, huyền phù nano được siêu âm đầu dò (UP50H, Công nghệ siêu âm Hielscher) ở biên độ 60% (đầu dò 6 mm) trong 10 phút trong chu kỳ BẬT 3 giây và TẮT 2 giây trên bồn nước đá. Các tinh thể nano thu được được khuấy thêm trong 6 giờ ở nhiệt độ phòng, bảo quản qua đêm ở 4 ° C không bị xáo trộn và thu thập bằng cách siêu ly tâm (Optima XPN-100 Ultracentrifuge) ở tốc độ 50.000 vòng / phút trong 30 phút ở 4 ° C.

Để chuẩn bị lipid-tinh thể nano (Lipid / PTX-NC), 60 mg HSPC, 30 mg Chol và 15 mg TPGS được hòa tan trong hỗn hợp chloroform và metanol 2: 1 v / v. Pha hữu cơ được bay hơi ở áp suất giảm bằng cách sử dụng thiết bị bay hơi quay ở 60 °C để tạo thành một màng mỏng. Màng khô được ngậm nước lại với 5 ml huyền phù tinh thể nano (tương đương với 100 mg NC khô) và khuấy trong khoảng 6 giờ ở 25 °C¹⁵. Nhiệt độ của huyền phù kết quả sau đó được giảm xuống 4 °C bằng cách sử dụng bể đá dưới khuấy liên tục. Sau đó, huyền phù lạnh được siêu âm trong 10 phút ở biên độ 45% bằng cách sử dụng đầu dò 6 mm (chu kỳ BẬT 3 giây và TẮT 2 giây) trong bồn tắm đá. Sau đó, huyền phù được bảo quản qua đêm ở 4 ° C và thu thập bằng cách ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng / phút trong 30 phút. Trầm tích được phân tán lại trong nước cất. Lipid / PTX-NC thu được được đông khô (Máy sấy đông lạnh, Alpha 1–2 LDplus Martin Christ, Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Đức) và được bảo quản ở nhiệt độ 4–8 ° C cho đến khi sử dụng tiếp.

Để chuẩn bị các tinh thể nano lipid được nhắm mục tiêu, 7,5 mg TPGS được thay thế bằng TPGS-COOH tổng hợp (chi tiết trong bổ sung; Bảng S1)¹⁶. Các Lipid / PTX-NC tinh khiết được phân tán lại được ủ với NHS và EDC trong 30 phút để kích hoạt TPGS-COOH, sau đó là bổ sung Cetuximab (2 mg cho 75 mg Lipid / PTX-NC) ở 4 ° C. Sự liên hợp giữa đầu cuối amin của cetuximab và TPGS-COOH được kích hoạt được phép xảy ra ở tốc độ 200 vòng / phút trong 6 giờ. Các tinh thể nano lipid nhắm mục tiêu (Cmab / Lipid / PTX-NC) sau đó được rửa sạch, đông khô và bảo quản ở nhiệt độ 4–8 ° C cho đến khi sử dụng tiếp. Để điều chế công thức được trang bị coumarin-6 (C6), 1 mg C6 được sử dụng cùng với 20 mg PTX trong quá trình điều chế NC.

Kích thước hạt, chỉ số đa phân tán (PDI), tiềm năng zeta, tải trọng thuốc và năng suất

Kích thước thủy động lực học, chỉ số đa phân tán (PDI) và tiềm năng zeta của PTX-NC, Lipid / PTX-NC và Cmab / Lipid / PTX-NC được xác định bằng quang phổ tương quan photon (PCS) sử dụng Malvern Zetasizer (v7.13, Malvern Panalytical Ltd., Vương quốc Anh). Tải trọng và năng suất thuốc được xác định bằng cách sử dụng HPLC (HPLC, Shimadzu, Nhật Bản) được trang bị bơm HPLC nhị phân Waters-1525 (Waters, Hoa Kỳ), kim phun thủ công rheodyne-7725i (Waters, Hoa Kỳ) và máy dò mảng điốt quang Waters-2998 (Waters, Hoa Kỳ). Cột C18 pha ngược (chiều dài 150 mm, đường kính 4,6 mm và kích thước hạt 3,5 μm) và pha di động bao gồm nước Acetonitrile: MilliQ (60:40) được sử dụng để rửa giải chất phân tích ở tốc độ dòng chảy 1 ml tối thiểu⁻¹. Phân tích được thực hiện ở bước sóng 229 nm¹⁴. Đối với điều này, trọng lượng đã biết của các tinh thể nano được thêm vào thể tích metanol đã biết, xoáy trong 5 phút và siêu âm trong 15 phút để phân hủy các tinh thể nano nguyên vẹn và thu được thuốc tự do trong metanol. Sau đó, dung dịch thu được được ly tâm ở tốc độ 15.000 vòng / phút để thu thập phần nổi trên được sử dụng để định lượng thuốc bằng phương pháp HPLC. Tải trọng và năng suất thuốc được tính toán như sau:

Tải trọng (%) = (Trọng lượng thuốc trong tinh thể nano / trọng lượng của tinh thể nano được sử dụng) × 100.

Năng suất (%) = (Tổng trọng lượng của các tinh thể nano thu được / tổng trọng lượng của chất rắn, tức là thuốc + chất ổn định + chất điều chỉnh bề mặt được sử dụng để tạo ra các tinh thể nano) × 100.

Nghiên cứu độ ổn định

Để đánh giá độ ổn định của các tinh thể nano, các tinh thể nano đông khô được bảo quản ở 4 °C trong 6 tháng. Kích thước thủy động lực học, PDI và điện thế zeta được ghi lại trong các khoảng thời gian được xác định trước (0, 0,5, 1, 2, 3 và 6 tháng) để đánh giá độ ổn định của các tinh thể nano^17,18.

Kích thước và hình thái của các tinh thể nano đã được điều tra bằng kính hiển vi điện tử. Đối với phân tích TEM (TechnaiG2 20 TWIN, FEI, USA), 20 mẫu pha loãng × được đúc trên lưới đồng phủ carbon và sấy khô trong không khí. Để chuẩn bị mẫu cho SEM, một giọt 20 × mẫu pha loãng được thả xuống slide thủy tinh và sấy khô chân không ở 25 °C. Trang trình bày đã chuẩn bị được phủ vàng bằng cách sử dụng máy phủ phún xạ (DSR1) trong 120 giây trước khi phân tích SEM (EVO MA15 / 18, Kính hiển vi Carl Zeiss). Các đặc điểm bề mặt như hình dạng và độ mịn cũng được quan sát dưới kính hiển vi đầu dò quét (SPM, NTEGRA Prima, NT-MDT Service and Logistics Ltd) và được phân tích bằng phần mềm Nova Powerscript 3.4.0 rev 16.681.

Đặc tính trạng thái rắn

PTX-NCs, Lipid / PTX-NC và Cmab / Lipid / PTX-NC cũng được nghiên cứu bằng các kỹ thuật quang phổ khác nhau bao gồm; Hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR), nhiễu xạ tia X dạng bột (XRD) và phép đo nhiệt lượng quét vi sai (DSC). Nghiên cứu FTIR được thực hiện bằng cách sử dụng SHIMADZU 8400 S, Tokyo, Nhật Bản. Đối với điều này, các viên PTX nguyên chất, Soluplus, SPPM (PTX tinh khiết và Soluplus dưới dạng hỗn hợp vật lý), PTX-NC, Lipid / PTX-NC và Cmab / Lipid / PTX-NC được chuẩn bị riêng lẻ với KBr (1: 5) bằng máy ép thủy lực và quá trình quét được thực hiện trong khoảng 4000 cm⁻¹ đến 600 cm⁻¹ ở độ phân giải 4 cm⁻¹ với tốc độ tích lũy 64 lần mỗi phút. Để xác nhận sự chuyển đổi của thuốc tinh thể thành tinh thể nano vô định hình (PTX-NC), tinh thể phủ lipid (Lipid / PTX-NC) và tinh thể mục tiêu (Cmab / Lipid / PTX-NC), nghiên cứu XRD đã được thực hiện. Mô hình nhiễu xạ thu được bằng cách sử dụng máy đo nhiễu xạ tia X dạng bột Rigaku Miniflex 600 được trang bị máy dò D / teX Ultra và các phép đo được đặt ở kích thước bước 0,02º ở tốc độ quét 5º mỗi phút trên 2θ của 5–50º. Nghiên cứu DSC được thực hiện ở tốc độ gia nhiệt 20 °C / phút trong phạm vi nhiệt độ − 25 −300 °C bằng cách sử dụng Shimadzu DSC-60 Plus.

Hóa học bề mặt và mức độ liên hợp

Thành phần nguyên tố của Lipid / PTX-NC và Cmab / Lipid / PTX-NC được xác định bằng cách sử dụng XPS (mô hình K-Alpha, Thermo Fisher Scientific) trên 100–700 năng lượng liên kết eV. Xét nghiệm Bradford được thực hiện để xác định mức độ liên hợp của cetuximab trên bề mặt Cmab / Lipid / PTX-NCs¹⁹. Albumin huyết thanh bò gốc (BSA) được sử dụng làm protein tiêu chuẩn để vẽ đường cong hiệu chuẩn. Đối với điều này, nồng độ BSA xác định được ủ ở + 37 °C trong 5 phút với thuốc thử của Bradford dẫn đến thay đổi màu sắc. Độ hấp thụ của thuốc thử liên kết BSA được đo ở 595 nm và đường cong hiệu chuẩn được vẽ ra, sau đó được sử dụng để xác định mức độ liên hợp cetuximab trên bề mặt tinh thể nano. Để định lượng cetuximab, Cmab / Lipid / PTX-NC đã rửa sạch được ủ với thuốc thử của Bradford trong 5 phút, đo độ hấp thụ và sau đó định lượng lượng bằng đường cong hiệu chuẩn tiêu chuẩn.

Phát hành thuốc trong ống nghiệm

Nghiên cứu giải phóng PTX, PTX-NCs, Lipid/PTX-NCs và Cmab/Lipid/PTX-NCs tinh khiết được thực hiện bằng phương pháp lọc máu. Vì PTX có khả năng hòa tan trong nước kém, 0,5% (w / v) Tween-80 đã được đưa vào ngăn chấp nhận để duy trì tình trạng bồn rửa. Tóm lại, mẫu phân tán trong 1 mL PBS (pH 7,4) được niêm phong trong túi lọc máu (8–14 kDa, HiMedia Laboratories Pvt. Ltd., Mumbai, Ấn Độ). Sau đó, các túi lọc máu được ngâm trong cốc với 20 mL môi trường chấp nhận được duy trì ở 37 ° C và tốc độ khuấy 100 vòng / phút. Tại các thời điểm cố định (0, 2, 4, 6, 12, 24 và 48 giờ), 1 mL tiền phân chia được rút ra và thay thế bằng PBS mới. Nồng độ PTX được xác định bằng phương pháp HPLC.

Nghiên cứu các dòng tế bào in vitro

Bảo trì dòng tế bào

Dòng tế bào A549, có nguồn gốc từ ung thư biểu mô phổi, được phát triển trong CO₂ lồng ấp với nhiệt độ và độ ẩm được kiểm soát ở 37 °C. Các tế bào được nuôi cấy trong DMEM được bổ sung FBS (Huyết thanh bò thai nhi) và dung dịch penicillin-streptomycin, cung cấp cho chúng các chất dinh dưỡng thiết yếu và bảo vệ chống lại ô nhiễm. Khi nuôi cấy tế bào đạt đến độ hợp lưu 70–80%, các tế bào được tách ra khỏi bề mặt nuôi cấy bằng dung dịch EDTA trypsin 0,25%, cho phép sử dụng chúng trong các quy trình thí nghiệm tiếp theo.

Xét nghiệm độc tính tế bào trong ống nghiệm

Độc tính tế bào của PTX, PTX-NC, Lipid / PTX-NC và Cmab / Lipid / PTX-NC tinh khiết được đánh giá trên dòng tế bào A549 bằng cách sử dụng xét nghiệm MTT (3- (4, 5-dimethylthiazolyl-2) −2, 5-diphenyltetrazolium bromide). Trong đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng, 7000 tế bào được gieo hạt trong mỗi giếng và để dính qua đêm. Sau đó, các tế bào được tiếp xúc với các nồng độ hợp chất khác nhau, từ 0,01 μg / ml đến 20 μg / ml và ủ trong 48 giờ. Sau thời gian ủ bệnh, môi trường nuôi cấy được loại bỏ và môi trường chứa MTT được thêm vào mỗi giếng. Sau khi ủ 2 giờ, môi trường chứa MTT được thay thế bằng 100 μl DMSO trong mỗi giếng. Đĩa được ủ thêm trong 30 phút để hòa tan các tinh thể formazan. Cuối cùng, sử dụng đầu đọc đĩa siêu nhỏ (Bio-Rad, Hoa Kỳ), độ hấp thụ được đo ở 570 nm để đánh giá tác dụng gây độc tế bào của các hợp chất được thử nghiệm. Tỷ lệ phần trăm khả năng tồn tại của tế bào trong mỗi giếng được tính bằng công thức;

Tỷ lệ phần trăm khả năng tồn tại của tế bào (%) = (Độ hấp thụ của mẫu ở 570 nm) / (Độ hấp thụ của đối chứng ở 570 nm) × 100.

Đánh giá hình thái hạt nhân thông qua nhuộm kép Hoechst 33342 / PI

Hơn nữa, để điều tra ảnh hưởng của PTX, PTX-NC, Lipid / PTX-NC và Cmab / Lipid / PTX-NC đối với hình thái hạt nhân và ngưng tụ, nhuộm kép Hoechst 33342 / PI đã được thực hiện. Đối với điều này, khoảng 3 × 10⁴ tế bào được gieo hạt trong đĩa nuôi cấy tế bào 12 giếng với 10% FBS và DMEM cùng với dung dịch kháng sinh pen-strep ủ trong 5% CO ẩm₂ vườn ươm cho sự phát triển và tuân thủ. Sau khi đạt được hình thái thích hợp, các tế bào được xử lý bằng tất cả các mẫu trên tại IC₅₀ nồng độ Cmab / Lipid / PTX-NC và ủ trong 48 giờ. Sau đó, môi trường đã qua sử dụng được loại bỏ, rửa sạch bằng PBS và sau đó nhuộm được thực hiện bằng Hoechst 33342 (10 μg / ml) và PI (5 μg / ml) và hình ảnh được chụp qua kính hiển vi tương phản pha ngược huỳnh quang (EVOS FL, Life technologies, Ấn Độ) ở độ phóng đại 400X.

Nghiên cứu tiềm năng màng ty thể thông qua nhuộm JC-1

Sự thay đổi tiềm năng màng ty thể có liên quan trực tiếp đến việc tạo ra ROS và chết tế bào²⁰. Khử cực ty thể là một phản ứng đáng kể của thuốc chống ung thư và là một chỉ số gián tiếp về nội hóa thuốc và nồng độ nội bào của nó. Thuốc nhuộm JC-1 thường được sử dụng để đánh giá quá trình khử cực ty thể, tạo ra các tập hợp J huỳnh quang màu đỏ (phân cực) và các monome J huỳnh quang màu xanh lá cây (khử cực). Tóm lại, 3 × 10⁴ các tế bào được gieo hạt trong đĩa nuôi cấy tế bào 12 giếng được bổ sung DMEM và 10% FBS và để nó để bám qua đêm. Sau đó, các tế bào được tiếp xúc với hoặc tại IC₅₀ nồng độ Cmab / Lipid / PTX-NC cho PTX, PTX-NC và Lipid / PTX-NC tinh khiết, sau đó ủ trong 48 giờ. Môi trường đã cạn kiệt được loại bỏ và sau đó nhuộm bằng JC-1dye cation (1 μM) và ủ trong 15 phút. Hình ảnh được chụp thông qua kính hiển vi tương phản pha huỳnh quang ngược (EVOS FL, Life technologies, Ấn Độ) ở độ phóng đại 400 X.

Hấp thu tế bào

Sự hấp thu tế bào của coumarin-6 tự do (C6), C6-PTX-NC, Lipid / C6-PTX-NC và Cmab / Lipid / C6-PTX-NC đã được nghiên cứu trong tế bào A549. Tóm lại, 30 × 10³ Các tế bào A549 được gieo trên tấm che trong đĩa nuôi cấy tế bào 12 giếng với DMEM cùng với 10% FBS và ủ trong 12 giờ trong 5% CO được làm ẩm₂ Incubator. Sau khi ủ, môi trường đã qua sử dụng được loại bỏ và nhuộm ngược được thực hiện bằng nhuộm DAPI. Hình ảnh được chụp thông qua kính hiển vi tương phản pha huỳnh quang ngược (EVOS FL, Life technologies, Ấn Độ) ở độ phóng đại 400 X.

Phân tích chu kỳ tế bào

Sự bắt giữ chu kỳ tế bào bởi PTX được tạo ra trong giai đoạn G2 / M để tránh tăng sinh tế bào. Sự sẵn có trong tế bào tăng cường của PTX trong tế bào chịu trách nhiệm cho việc bắt giữ chu kỳ tế bào trong giai đoạn G2 / M. Để điều tra vai trò của PTX, PTX-NC, Lipid / PTX-NC và Cmab / Lipid / PTX-NC trong việc trì hoãn chu kỳ tế bào hoặc ngừng tăng trưởng, nghiên cứu phân tích chu kỳ tế bào được thực hiện thông qua phép đo tế bào dòng chảy. Đối với điều này, 80.000 tế bào được gieo trong đĩa nuôi cấy tế bào 6 giếng cùng với DMEM và 10% FBS và ủ qua đêm trong 5% CO được làm ẩm₂ vườn ươm cho sự phát triển và tuân thủ. Sau đó, các tế bào được tiếp xúc với PTX, PTX-NC, Lipid / PTX-NC và Cmab / Lipid / PTX-NC tại IC₅₀ nồng độ Cmab / Lipid / PTX-NC và sau đó ủ trong 48 giờ trong 5% CO ẩm₂ Incubator. Sau khi ấp, các tế bào được thu hoạch với sự trợ giúp của dung dịch EDTA 0,5M và sau đó ly tâm ở tốc độ 3000 vòng / phút trong 10 phút. Sau đó, phần nổi trên được loại bỏ và sau đó các tế bào được cố định bằng etanol 80% qua đêm. Sau đó, các tế bào được ly tâm ở tốc độ 3000 vòng / phút trong 7 phút và phần nổi trên được loại bỏ, sau đó các tế bào được nhuộm bằng RNase và propidium iodide và ủ trong 15 phút và sau đó được phân tích thông qua Flowcytometer (Cytofelx Beckman Coulter).

Nghiên cứu in vivo

Tất cả các phác đồ thử nghiệm đã được Ủy ban Đạo đức Động vật Thể chế (IAEC) phê duyệt (Số phê duyệt: IIT (BHU) / IAEC / 2024 / I / 009). Tất cả các thí nghiệm in vivo được thực hiện theo hướng dẫn của CPCSEA (Ủy ban về Mục đích Kiểm soát và Giám sát Thí nghiệm trên Động vật, Đăng ký số 2123/GO/Re/S/21/CPCSEA). Các phương pháp được báo cáo theo hướng dẫn của ARRIVE.

Động vật: Những con chuột khỏe mạnh (Thụy Sĩ-bạch tạng, đực, 20–25 g) được sử dụng cho thí nghiệm, duy trì ở 22 ° C trong chu kỳ sáng / tối 12 giờ và cho ăn chế độ ăn viên tiêu chuẩn và nước tùy ý.

Phát triển mô hình ung thư phổi:B(a)P (50 mg / kg) trong dầu ngô được dùng bằng cách uống với liều hai lần một tuần (Ngày 0, 3, 7, 10, 14, 17, 21, 24, 28) trong 4 tuần để gây ung thư phổi²¹.

Xây dựng: Để sử dụng PTX tinh khiết làm đối chứng dương tính, PTX được hòa tan trong Kolliphor EL (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) và hỗn hợp etanol (1: 1) và pha loãng với PBS (khử trùng bằng cách lọc qua bộ lọc 0,2 μm) để thu được dung dịch PTX 2 mg / ml. Các tinh thể nano cũng được lơ lửng trong PBS với cùng nồng độ để tiêm tĩnh mạch trong tĩnh mạch đuôi bên.

Hồi quy khối u, đánh giá mô học và phân tích sống sót

Đối với nghiên cứu in vivo, 5 nhóm (n = 6 chuột bị ung thư phổi) đã được sử dụng, tiêm tĩnh mạch (tĩnh mạch đuôi) với PTX tinh khiết, PTX-NC, Lipid / PTX-NC và Lipid / PTX-NC nhắm mục tiêu. Một nhóm được điều trị bằng dung dịch muối (đối chứng âm tính). Những con vật được điều trị với liều 10 mg / kg PTX tương đương hai lần một tuần trong tổng cộng ba tuần. Trọng lượng của chuột được ghi lại trong khoảng thời gian xác định trước. Cuối cùng, động vật được an tử bằng cách tiêm bắp ketamine liều cao (300 mg / kg) và cocktail xylazine (30 mg / kg), để thu thập các mẫu phổi khử nước với 95% ethanol và cố định trong formalin 10% để nghiên cứu mô học. Để phân tích tỷ lệ sống sót, những con chuột bị ung thư phổi được chia thành năm nhóm (n = 6) và được điều trị bằng nước muối sinh lý (đối chứng), PTX tinh khiết, PTX-NC, Lipid / PTX-NC và Lipid nhắm mục tiêu / PTX-NC trong ba tuần. Những con chuột được nuôi trong 120 ngày và số lượng tử vong cá nhân được ghi nhận trong suốt thời gian nghiên cứu. Tỷ lệ sống sót trung bình của mỗi nhóm được xác định bằng biểu đồ sống sót Kaplan-Mier so với động vật khỏe mạnh bình thường và chuột mang khối u được điều trị bằng nước muối.

Nghiên cứu dược động học và phân phối sinh học

Đối với nghiên cứu dược động học và phân phối sinh học, chuột đực được chia thành bốn nhóm (n = 18). Điều trị được thực hiện bằng cách tiêm tĩnh mạch PTX, PTX-NCs, Lipid/PTX-NCs và Cmab/Lipid/PTX-NCs với liều tương đương là 10 mg/kg PTX. Tại các thời điểm cố định (0,5, 1, 3, 6, 12 và 24 giờ), ba con chuột được sử dụng để thu thập mẫu máu, sau đó an tử cho tất cả các cơ quan chính bao gồm gan, phổi, tim, lá lách, thận và não. Các cơ quan được cân, treo lại trong ACN (thể tích bằng gấp đôi trọng lượng) và đồng nhất (máy đồng nhất tốc độ cao IKA T10 Basic ULTRA-TURRAX, Đức). Các mẫu máu được thu thập trong ống EDTA được sử dụng để tách huyết tương sau khi ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng / phút trong 10 phút. Sau đó, mô và huyết tương (200 μL) được ủ trong 10 phút bằng cách sử dụng bể siêu âm, và thêm docetaxel (15 μL) làm tiêu chuẩn bên trong. Mỗi mẫu được xoáy trong 1 phút, sau đó ủ trong 5 phút ở RT và xoáy trong 5 phút để cho phép chiết xuất PTX. Sau khi ly tâm ở 10.000 vòng / phút trong 5 phút, phần nổi trên được thu thập và phân tích bằng HPLC.

Các thí nghiệm được thực hiện ba lần và dữ liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± SD. Các phân tích thống kê được thực hiện bằng cách sử dụng GraphPad Prism 9.0.0 (Phần mềm GraphPad, San Diego, CA, Hoa Kỳ). Để xác định ý nghĩa thống kê giữa các nhóm, thử nghiệm t của học sinh hai bên không ghép nối, ANOVA một chiều và ANOVA hai chiều đã được áp dụng. Các giá trị có p < 0,05 (*), p < 0,01 (**), p < 0,001 (***) và p < 0,0001 (****) được coi là có ý nghĩa, trong khi p > 0,05 (ns) được coi là không có ý nghĩa.

Nghiên cứu hiện tại cho thấy việc chế tạo các tinh thể nano biến đổi phospholipid và liên hợp cetuximab để phân phối thuốc đến ung thư. Các tinh thể nano đồng nhất và ổn định, với kích thước hạt dưới 200 nm. Phân tích quang phổ đã xác nhận sự chuyển đổi của các thuốc tinh thể thành các hạt vô định hình khi được chế tạo dưới dạng tinh thể nano. Sự biến đổi lipid thành công và liên hợp cetuximab trên bề mặt tinh thể nano cũng được quan sát thấy. Các nghiên cứu dòng tế bào trong ống nghiệm đã xác nhận vai trò của các tinh thể nano trong việc gây độc tính tế bào cao hơn trong tế bào ung thư A549 và gây ra quá trình chết rụng tế bào bằng cách cải thiện sự hấp thu PTX của tế bào và cung cấp sự ngừng chu kỳ tế bào ở giai đoạn G2 / M, tất cả cùng nhau chịu trách nhiệm cho hiệu quả chống khối u cao hơn của các tinh thể nano trong tế bào A549, bằng chứng là giảm IC₅₀ giá trị. Các nghiên cứu in vivo cho thấy hiệu lực của tinh thể nano trong việc kiểm soát sự phát triển của khối u, kéo dài thời gian sống sót và giảm độc tính PTX để cung cấp một loại thuốc an toàn hơn cho điều trị ung thư. Kết quả cho thấy các tinh thể nano liên hợp được biến đổi phospholipid và cetuximab như một chất mang nano mới để phân phối thuốc cụ thể tại chỗ và điều trị ung thư.

Nghiên cứu chế tạo hệ dẫn thuốc nano Paclitaxel phối hợp Curcumin và đánh giá tác động của chúng lên các tế bào ung thư