Xơ hóa thận liên quan đến phân tử do vi khuẩn đường ruột tạo ra

CHAMPAIGN, Ill. – Một phân tử được tạo ra bởi vi khuẩn trong ruột có thể đi nhờ đến thận, nơi nó gây ra phản ứng dây chuyền của viêm, sẹo và xơ hóa – một biến chứng nghiêm trọng của bệnh tiểu đường và là nguyên nhân hàng đầu gây suy thận – theo một nghiên cứu mới từ các nhà nghiên cứu tại Đại học Illinois Urbana-Champaign và Đại học Mie ở Nhật Bản.

Sau khi tìm thấy mức độ cao của corisin – một peptide nhỏ được tạo ra bởi vi khuẩn Staphylococcus trong ruột – trong máu của bệnh nhân xơ hóa thận do tiểu đường, các nhà nghiên cứu đã sử dụng mô phỏng máy tính và thí nghiệm mô và chuột để theo dõi corisin ảnh hưởng đến thận như thế nào, cách nó đến đó từ đường ruột và một phương pháp khả thi để chống lại nó bằng phương pháp điều trị kháng thể.

“Các nghiên cứu trước đây của chúng tôi cho thấy corisin có thể làm hỏng tế bào và làm trầm trọng thêm sẹo mô và xơ hóa ở các cơ quan khác, vì vậy chúng tôi nghi ngờ nó có thể là một động lực tiềm ẩn của xơ hóa thận”, giáo sư khoa học động vật Illinois Isaac Cann, người đứng đầu nghiên cứu với giáo sư miễn dịch học của Đại học Mie, Tiến sĩ Esteban Gabazza cho biết. Cann và Gabazza là chi nhánh của Viện Sinh học Bộ gen Carl R. Woese tại Illinois. “Những phát hiện mới của chúng tôi cho thấy corisin thực sự là thủ phạm ẩn đằng sau tổn thương thận tiến triển trong bệnh tiểu đường và việc ngăn chặn nó có thể cung cấp một cách mới để bảo vệ sức khỏe thận ở bệnh nhân.”

Các nhà nghiên cứu đã công bố phát hiện của họ trên tạp chí Nature Communications.

Xơ hóa thận do tiểu đường là nguyên nhân chính gây suy thận trên toàn thế giới, nhưng các động lực chính của nó vẫn còn là một bí ẩn và không có phương pháp điều trị nào có thể ngăn chặn quá trình này, Tiến sĩ Taro Yasuma của Đại học Mie, một bác sĩ y khoa và là tác giả đầu tiên của bản thảo cho biết.

“Nhiều người mắc bệnh tiểu đường lâu năm cuối cùng phát triển xơ hóa thận, và một khi nó tiến triển, có những lựa chọn hạn chế ngoài lọc máu hoặc ghép thận. Các phương pháp điều trị hiện tại chủ yếu tập trung vào việc kiểm soát lượng đường trong máu và huyết áp, nhưng không có cách chữa trị nào ngăn chặn hoặc đảo ngược quá trình sẹo hoặc xơ hóa”, Yasuma nói.

Các nhà nghiên cứu bắt đầu bằng cách sàng lọc máu và nước tiểu của bệnh nhân mắc bệnh thận tiểu đường. Họ phát hiện ra rằng bệnh nhân có nhiều corisin hơn đáng kể so với những người khỏe mạnh của họ và lượng corisin trong máu tương quan với mức độ tổn thương thận.

Khi thấy kết quả tương tự ở chuột bị xơ hóa thận, các nhà nghiên cứu đã theo dõi những gì corisin đang làm trong thận của chuột. Họ phát hiện ra rằng corisin đẩy nhanh quá trình lão hóa trong tế bào thận, gây ra phản ứng dây chuyền từ viêm đến chết tế bào đến sự tích tụ của mô sẹo, cuối cùng dẫn đến mất chức năng thận và xơ hóa tồi tệ hơn.

Nhưng corisin đi từ ruột đến thận như thế nào? Các nhóm của Cann và Gabazza đã hợp tác với nhóm của giáo sư kỹ thuật hóa học và sinh học phân tử Diwakar Shukla để tạo ra các mô phỏng máy tính và thí nghiệm trong phòng thí nghiệm để theo dõi hành trình của corisin từ ruột đến máu. Họ phát hiện ra rằng corisin có thể gắn vào albumin, một trong những protein phổ biến nhất trong máu và đi qua máu. Khi đến thận, corisin tách ra khỏi albumin để tấn công các cấu trúc mỏng manh lọc máu và nước tiểu.

Để xác nhận rằng corisin là thủ phạm chính đằng sau tổn thương thận, các nhà nghiên cứu đã cung cấp cho chuột các kháng thể chống lại corisin. Họ thấy tốc độ tổn thương thận giảm đáng kể.

“Khi chúng tôi điều trị cho những con chuột bằng một kháng thể trung hòa corisin, nó làm chậm quá trình lão hóa của tế bào thận và giảm đáng kể sẹo thận”, Gabazza, người cũng là giáo sư khoa học động vật tại Illinois cho biết. “Mặc dù hiện không có kháng thể nào như vậy được chấp thuận để sử dụng ở người, nhưng phát hiện của chúng tôi cho thấy nó có thể được phát triển thành một phương pháp điều trị mới.”

Tiếp theo, các nhà nghiên cứu có kế hoạch thử nghiệm các phương pháp điều trị kháng corisin trong các mô hình động vật tiên tiến hơn, chẳng hạn như lợn, để khám phá cách chúng có thể được điều chỉnh để sử dụng an toàn ở người. Đại học I. và Đại học Mie có một tiết lộ phát minh chung về kháng thể corisin.

“Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy rằng việc ngăn chặn corisin, bằng kháng thể hoặc các liệu pháp nhắm mục tiêu khác, có thể làm chậm hoặc ngăn ngừa sẹo thận trong bệnh tiểu đường và do đó nâng cao chất lượng cuộc sống cho bệnh nhân”, Cann nói.

Nghiên cứu này được hỗ trợ bởi Cơ quan Khoa học và Công nghệ Nhật Bản, Hiệp hội Xúc tiến Khoa học Nhật Bản, Quỹ Khoa học Takeda,

Hiệp hội Giáo dục và Chăm sóc Bệnh tiểu đường Nhật Bản, Tài trợ Nghiên cứu Đổi mới Nhật Bản Eli Lilly, Quỹ An ninh Daiwa và Tổ chức Gia đình Charles và Margaret Levin. Cann cũng là giáo sư vi sinh và khoa học dinh dưỡng và là thành viên của Trung tâm Nghiên cứu Đông Á và Thái Bình Dương tại Illinois.

---

Corisin có nguồn gốc từ hệ vi sinh vật đẩy nhanh quá trình xơ hóa thận bằng cách thúc đẩy quá trình lão hóa tế bào
Trừu tượng
Tỷ lệ mắc bệnh thận do tiểu đường ngày càng tăng trên toàn cầu gây ra gánh nặng đáng kể về sức khỏe và kinh tế. Hiện nay, các liệu pháp chống xơ hóa hiệu quả để kiểm soát xơ hóa thận liên quan đến bệnh thận mãn tính đang thiếu. Nghiên cứu này cho thấy corisin, một peptide có nguồn gốc từ hệ vi sinh vật, là động lực trung tâm trong sự tiến triển của xơ hóa thận do tiểu đường. Nồng độ corisin được phát hiện là tăng rõ rệt trong huyết thanh của bệnh nhân mắc bệnh thận mãn tính do tiểu đường so với các đối chứng khỏe mạnh, với mối tương quan chặt chẽ với các giai đoạn bệnh tiến triển và suy giảm chức năng thận. Trong mô hình xơ hóa thận ở chuột, nồng độ corisin cũng tăng cao tương tự, góp phần trực tiếp làm tăng viêm và làm trầm trọng thêm xơ hóa và suy thận. Đáng chú ý, việc sử dụng kháng thể kháng corisin đơn dòng làm giảm đáng kể mức độ nghiêm trọng của bệnh thận ở chuột mắc bệnh tiểu đường. Thông qua mô phỏng động lực học phân tử và xác nhận thực nghiệm, chúng tôi đã chứng minh rằng corisin tương tác với albumin huyết thanh của con người, có khả năng tăng cường tích tụ thận và tác động bệnh lý của nó. Cơ chế gây bệnh của corisin liên quan đến việc tăng tốc độ lão hóa tế bào và cảm ứng quá trình chuyển đổi biểu mô-trung mô và apoptosis trong tế bào thận. Những phát hiện này nhấn mạnh vai trò quan trọng của corisin trong bệnh thận tiểu đường tiến triển và gợi ý một mục tiêu mới đầy hứa hẹn để can thiệp điều trị.

Giới thiệu
Tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường (DM) ngày càng tăng đã nổi lên như một thách thức sức khỏe toàn cầu quan trọng, gây ra gánh nặng kinh tế đáng kể cho các xã hội trên toàn thế giới 1,2,3. Dữ liệu dịch tễ học gần đây nhấn mạnh mức độ đáng báo động của vấn đề này, tiết lộ rằng 536,6 triệu cá nhân, chiếm tỷ lệ hiện mắc ước tính là 10,5%, bị ảnh hưởng bởi DM trên toàn thế giới vào năm 20214. Tỷ lệ hiện mắc dự kiến sẽ tăng lên 12,2%, ảnh hưởng đến 783,2 triệu người, vào năm 20454. Mức độ nghiêm trọng của tình hình được kết hợp bởi mối liên hệ của DM với tỷ lệ mắc bệnh và tử vong tăng cao. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), tỷ lệ tử vong do DM ở các nhóm tuổi khác nhau tăng 3% từ năm 2000 đến năm 2019, dẫn đến khoảng 1,5 triệu ca tử vong trên toàn cầu vào năm 2019 do DM3 trực tiếp. Thủ phạm chính góp phần vào tỷ lệ mắc bệnh và tử vong cao liên quan đến DM là bệnh vi mạch và bệnh mạch lớn 5,6,7,8,9,10. Đáng chú ý, bệnh thận tiểu đường nổi bật là một trong những biến chứng phổ biến nhất, giả định vai trò là nguyên nhân hàng đầu gây ra bệnh thận mãn tính và bệnh thận giai đoạn cuối 6,9,11,12. Dân số bệnh tiểu đường ngày càng tăng này và các biến chứng liên quan, đặc biệt là bệnh thận do tiểu đường, nhấn mạnh nhu cầu cấp bách về các chiến lược toàn diện để quản lý và giảm thiểu tác động của bệnh tiểu đường đối với sức khỏe toàn cầu.

Các đặc điểm chức năng và mô bệnh học độc đáo của bệnh thận tiểu đường bao gồm protein niệu, tăng tăng sinh tế bào, tăng cường lắng đọng ma trận trong trung gian và kẽ thận, teo ống và dày lên màng đáy cầu thận, dẫn đến xơ hóa cầu thận và xơ hóa kẽ ống, góp phần làm giảm tỷ lệ lọc cầu thận13,14. Những thay đổi xơ hóa này trong thận có thể dẫn đến tổn thương không thể phục hồi, cuối cùng dẫn đến bệnh thận giai đoạn cuối. Hiện tại, không có cách chữa trị dứt điểm cho xơ hóa thận liên quan đến DM. Các lựa chọn điều trị chủ yếu xoay quanh việc kiểm soát tăng đường huyết, protein niệu và tăng huyết áp động mạch, giảm nguy cơ tim mạch, giảm các triệu chứng và thực hiện các liệu pháp thay thế thận trong các trường hợp suy giảm chức năng thận nghiêm trọng. Các tác động chính của rối loạn đường huyết đối với thận bao gồm tổn thương, kích hoạt và/hoặc quá trình chết rụng của các tế bào nội mô cầu thận, tế bào chân và tế bào biểu mô ống thận, cũng như hoạt động quá mức của hệ thống renin-angiotensin-aldosterone trong thận13,15. Các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng những thay đổi trong hệ vi sinh vật hoặc loạn khuẩn có thể đóng một vai trò trong sự tiến triển của bệnh thận tiểu đường16,17,18. Dysbiosis có liên quan đến việc sản xuất quá mức và tích tụ các chất chuyển hóa do vi khuẩn, bao gồm urease, p-cresol và acetate, có khả năng góp phần gây ra stress oxy hóa, quá trình chết rụng tế bào thận, viêm và hoạt động profibrotic 19,20,21,22. Đáng chú ý, các nghiên cứu gần đây đã chứng minh sự hiện diện của vi khuẩn có nguồn gốc từ đường ruột trong thận của chuột tăng huyết áp tự phát và bệnh nhân tăng huyết áp động mạch23. Loạn khuẩn cũng có liên quan đến đợt cấp đột ngột của suy thận hoặc tổn thương thận cấp tính24,25,26. Ngoài ra, nghiên cứu gần đây của chúng tôi đã xác định corisin, một peptide có nguồn gốc từ hệ vi sinh vật, là một tác nhân tiềm năng gây ra quá trình apoptosis tế bào ống thận, tiếp tục liên quan đến hệ vi sinh vật trong cơ chế bệnh sinh của xơ hóa thận27,28.

Dựa trên nền tảng này, chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng corisin góp phần vào sự tiến triển của xơ hóa thận, một đặc điểm bệnh lý chính của bệnh thận mạn do tiểu đường. Nhìn chung, nghiên cứu của chúng tôi chứng minh rằng nồng độ corisin tuần hoàn tăng tương quan với mức độ nghiêm trọng của bệnh và rối loạn chức năng thận ở bệnh nhân DM và với sự gia tăng xơ hóa thận trong các mô hình chuột. Sử dụng corisin toàn thân có liên quan đến xơ hóa thận, trong khi sự ức chế của nó làm giảm sự tiến triển của bệnh thận tiểu đường trong các mô hình động vật thực nghiệm. Về mặt cơ học, corisin tương tác với albumin huyết thanh của con người, tạo điều kiện thuận lợi cho việc vận chuyển nó đến thận, nơi nó đẩy nhanh quá trình lão hóa tế bào và gây ra quá trình apoptosis hoặc chuyển đổi biểu mô-trung mô, thúc đẩy quá trình hình thành sợi. Những phát hiện này nhấn mạnh tiềm năng của việc nhắm mục tiêu vào con đường corisin như một chiến lược đầy hứa hẹn để giảm thiểu sự tiến triển của bệnh thận tiểu đường.

Kết quả
Nồng độ corisin tuần hoàn cao ở bệnh nhân mắc bệnh thận mạn do tiểu đường
Ban đầu, chúng tôi cho rằng nồng độ tuần hoàn của corisin có nguồn gốc từ hệ vi sinh vật bị rối loạn điều hòa ở bệnh nhân mắc bệnh thận mạn do tiểu đường. Để kiểm tra giả thuyết này, chúng tôi đã định lượng nồng độ corisin trong huyết thanh từ quần thể bệnh nhân này (Bảng bổ sung 1). Phân tích của chúng tôi cho thấy nồng độ corisin huyết thanh tăng rõ rệt ở bệnh nhân mắc bệnh thận mạn do tiểu đường so với các đối chứng khỏe mạnh. Hơn nữa, nồng độ corisin huyết thanh cũng cao hơn đáng kể ở những bệnh nhân mắc bệnh thận mạn không do tiểu đường so với những người khỏe mạnh. Tuy nhiên, không có sự khác biệt đáng kể nào được quan sát thấy giữa nhóm CKD tiểu đường và không mắc bệnh tiểu đường. Đáng chú ý, nồng độ corisin huyết thanh tăng đáng kể ở bệnh nhân mắc bệnh thận mạn do tiểu đường ở giai đoạn G2 đến G4 so với những người ở giai đoạn G1 (Hình E). 1A, B). Phân tích thu thập nước tiểu trong 24 giờ cho thấy không có sự khác biệt đáng kể giữa các phân nhóm G1 và G2-G4 trong quá trình bài tiết corisin hoặc albumin trong nước tiểu hàng ngày (Hình bổ sung. 1).

Hình 1: Tăng nồng độ corisin trong huyết thanh ở bệnh nhân thận mãn tính do tiểu đường.
figure 1
Ba mươi lăm bệnh nhân đã được ghi danh vào nghiên cứu. Mười ba bệnh nhân bị loại trừ do điều trị chống ung thư đang diễn ra, bộ dữ liệu không đầy đủ hoặc chất lượng mẫu dưới mức tối ưu. B Dữ liệu từ 20 đối tượng khỏe mạnh đóng vai trò là đối chứng. Bệnh nhân mắc bệnh thận mãn tính do tiểu đường được phân chia thành hai nhóm: một nhóm có giai đoạn G1 (n = 16) và một nhóm khác có giai đoạn G2, G3 và G4 (n = 19). Năm bệnh nhân mắc bệnh thận mãn tính không do tiểu đường cũng được đưa vào nghiên cứu. Dữ liệu được biểu thị dưới dạng mean ± SD. Ý nghĩa thống kê được xác định bằng cách sử dụng ANOVA một chiều, sau đó là thử nghiệm hậu kỳ Newman-Keuls để so sánh giữa ba nhóm. C Trình tự corisin và corisin-like peptide được xác định trong nước tiểu của bệnh nhân mắc bệnh thận mạn tính do tiểu đường (DM-CKD) và các đối chứng khỏe mạnh (HC). Các loài Staphylococcus là nguồn corisin chính ở bệnh nhân tiểu đường mắc bệnh thận mãn tính. Các trình tự được căn chỉnh bằng cách sử dụng DECIPHER, bao gồm hai trình tự tham chiếu (S. nepalensis: GenBank CP120099.1; S. haemolyticus: GenBank CP071512.1). ID trình tự đại diện cho sự trùng khớp cấp loài gần nhất, kèm theo một mã định danh duy nhất tương ứng với trình tự ban đầu. D Một bản đồ nhiệt hiển thị số lần đọc từ ID trình tự, đại diện cho các trình tự peptide duy nhất từ các amplicon ban đầu, đã được sử dụng để bình thường hóa sự phong phú tương đối giữa các bệnh nhân. Dữ liệu được vẽ trên thang đo log10 bằng cách sử dụng phyloseq. Dữ liệu nguồn có sẵn trong tệp Dữ liệu nguồn.

Hình ảnh kích thước đầy đủ
Mối tương quan nghịch đảo đã được quan sát thấy giữa nồng độ corisin huyết thanh và tỷ lệ lọc cầu thận ước tính (eGFR), trong khi mối tương quan trực tiếp được ghi nhận với huyết áp tâm thu và creatinin huyết thanh và mức cholesterol toàn phần (Hình bổ sung. 2). Chúng tôi cũng tiến hành phân tích đơn biến và đa biến, sử dụng eGFR làm biến phụ thuộc. Các biến có giá trị p nhỏ hơn 0,05 trong mối quan hệ đơn biến của chúng với eGFR đã được đưa vào phân tích đa biến. Nồng độ corisin huyết thanh có tương quan độc lập và nghịch với eGFR, phù hợp với giảm độ thanh thải thận (Bảng bổ sung 2). Ngoài ra, nồng độ corisin huyết thanh cơ bản cho thấy xu hướng gia tăng ở những bệnh nhân mắc bệnh thận do tiểu đường giảm eGFR lớn hơn trong thời gian theo dõi hai năm (>4 mL/phút/1,73 m²) so với những người có mức giảm thấp hơn (<4 mL/phút/1,73 m²), cho thấy vai trò tiềm năng của corisin trong sự tiến triển của suy giảm chức năng thận ở bệnh nhân CKD do tiểu đường (Hình bổ sung. 3).

Các loài tụ cầu khuẩn là nguồn corisin chính ở bệnh nhân tiểu đường mắc bệnh thận mạn
Trước đây, chúng tôi đã phân lập corisin và peptide giống corisin từ mô phổi của chuột bị xơ phổi, xác định vi khuẩn cộng sinh hoặc gây bệnh từ các loài Staphylococcus là nguồn chính của chúng27,29. Sau khi xác nhận sự hiện diện của corisin peptide trong nước tiểu thông qua các xét nghiệm miễn dịch, chúng tôi nhằm xác định nguồn gốc của các peptide này ở bệnh nhân mắc bệnh thận mạn do tiểu đường. Chúng tôi đã chuẩn bị DNA từ nước tiểu của những bệnh nhân này và khuếch đại các đoạn DNA mã hóa các peptide giống corisin / corisin. Để phát triển các mồi PCR khuếch đại đặc biệt DNA mã hóa các peptide proapoptotic trong mỗi mẫu nước tiểu, chúng tôi đã tạo ra một sự liên kết lớn của các trình tự polypeptide của các transglycosylase giống IsaA từ các vi khuẩn khác nhau. Chúng tôi đã xác định được hai trình tự bảo tồn cao bên cạnh các peptide proapoptotic (SVKAQF và WGTGSV), tạo điều kiện thuận lợi cho việc thiết kế hai mồi Corisin-F (5’ATCAGTTAAAGCTCAATTC) và Corisin-R (5’GCTACTGAACCAGTACCCCATG). Cặp mồi này khuếch đại thành công các đoạn DNA ~ 150 bp, kích thước dự đoán của trình tự mã hóa cho các peptide proapoptotic. Giải trình tự DNA và phân tích tin sinh học tiếp theo của các peptide giống corisin / corisin trong các mẫu nước tiểu cho thấy chúng khớp với những peptide có trong các loài Staphylococcus khác nhau với bộ gen được báo cáo trong cơ sở dữ liệu Genbank (Hình E). 1C, D, Bộ dữ liệu bổ sung 1). Những kết quả này xác nhận sự hiện diện của corisin và peptide giống corisin trong dịch của người và thiết lập các loài Staphylococcus là nguồn chính của chúng ở bệnh nhân CKD tiểu đường.

Nồng độ corisin tuần hoàn và nước tiểu cao ở chuột mắc bệnh thận mạn do tiểu đường
Vì xơ hóa thận là một dấu hiệu nổi bật của bệnh thận mạn, chúng tôi đã tìm cách xác nhận nồng độ corisin bất thường được quan sát thấy ở bệnh nhân mắc bệnh thận mạn do tiểu đường bằng cách so sánh nồng độ corisin trong huyết tương và nước tiểu giữa chuột loại hoang dã (WT) bình thường và chuột chuyển gen (TG) yếu tố tăng trưởng biến đổi-β1 (TGFβ1) đặc hiệu thận bị xơ hóa thận. Nồng độ corisin trong huyết tương và nước tiểu tăng đáng kể ở chuột TGFβ1 TG bị xơ hóa thận so với đối chứng WT. Ngoài ra, nồng độ TGFβ1 trong huyết tương và nước tiểu đã tăng đáng kể ở chuột chuyển gen TGFβ1 (TG) so với đối chứng WT (Hình bổ sung. 4A–C). Tuy nhiên, không có mối tương quan đáng kể nào được quan sát thấy giữa nồng độ corisin và TGFβ1 trong huyết tương (r = −0,09, p = 0,65) hoặc nước tiểu (−0,18, p = 0,37), cho thấy TGFβ1 có thể không điều chỉnh trực tiếp biểu hiện corisin.

Để xác định xem DM có làm trầm trọng thêm mức độ corisin bất thường hay không, chúng tôi đã đo và so sánh nồng độ corisin trong huyết tương và mẫu nước tiểu được thu thập từ chuột TGFβ1 TG mắc bệnh tiểu đường và không mắc bệnh tiểu đường bị xơ hóa thận. Chúng tôi quan sát thấy sự gia tăng đáng kể nồng độ corisin trong huyết tương và nước tiểu ở chuột TGFβ1 TG mắc bệnh xơ hóa thận so với các đối tác không mắc bệnh tiểu đường (Hình bổ sung. 4D–F). Để điều tra xem liệu những thay đổi tương tự trong nồng độ corisin tuần hoàn có xảy ra trong một mô hình thí nghiệm khác nhau của DM hay không, chuột WT cắt bỏ thận một bên, có hoặc không có bệnh thận tiểu đường, đã được chuẩn bị và đo nồng độ corisin trong huyết tương. Trong mô hình này, cắt bỏ thận một bên đẩy nhanh sự tiến triển của bệnh thận tiểu đường. Phù hợp với những phát hiện từ chuột chuyển gen TGFβ1 bị xơ hóa thận tự phát và chuột TGFβ1 TG bị bệnh thận tiểu đường, nồng độ corisin trong huyết tương tăng đáng kể ở chuột WT bị xơ hóa thận do tiểu đường so với đối chứng WT không mắc bệnh tiểu đường (Hình bổ sung. 4G–I). Nhìn chung, những quan sát này cho thấy mối liên hệ tiềm ẩn giữa corisin và xơ hóa thận, đặc biệt là trong các tình trạng tiểu đường.

Sử dụng corisin toàn thân có liên quan đến tăng xơ hóa thận
Với các quan sát của chúng tôi về nồng độ corisin tăng cao trong các tình trạng liên quan đến bệnh thận và vai trò được ghi nhận của corisin trong đợt cấp xơ hóa nội tạng, chúng tôi cho rằng corisin có thể góp phần gây ra bệnh thận bằng cách đẩy nhanh sự tiến triển của xơ hóa thận27,30. Để khám phá giả thuyết này, chúng tôi đã sử dụng corisin tổng hợp một cách có hệ thống cho chuột chuyển gen TGFβ1 bị xơ hóa thận, một mô hình mà chúng tôi đã mô tả trước đây31. Corisin tổng hợp hoặc peptide xáo trộn đối chứng được sử dụng trong phúc mạc cho chuột TGFβ1 TG ba lần mỗi tuần trong hai tuần (Hình E). Kết quả cho thấy chuột TGFβ1 TG được điều trị bằng corisin cho thấy sự gia tăng đáng kể tỷ lệ corisin, albumin và albumin-to-creatinine trong nước tiểu. Nồng độ nitơ urê trong huyết tương (BUN) và nồng độ protein liên kết axit béo loại gan (L-FABP) trong nước tiểu cũng tăng đáng kể ở chuột TGFβ1 TG nhận corisin trong phúc mạc so với các đối tác không được điều trị (Hình E). 2B, C). Đúng như dự đoán, nồng độ corisin huyết tương đã tăng lên đáng kể ở những con chuột TGFβ1 TG nhận corisin tổng hợp trong phúc mạc so với các đối tác của chúng nhận được peptide xáo trộn. Về mặt định lượng, nồng độ corisin lưu thông trung bình ở chuột được điều trị bằng corisin cao hơn 2,2 lần so với những gì quan sát thấy ở bệnh nhân CKD tiểu đường và cao hơn 1,6 lần so với những con chuột chuyển gen TGFβ1 do tiểu đường. Mức độ lưu thông của chemokine CXC do lipopolysaccharide gây ra (LIX / CXCL5), protein viêm đại thực bào-2 (MIP-2), interleukin-1β (IL-1β), yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu (PDGF), yếu tố mô (TF) và chất ức chế chất kích hoạt plasminogen-1 (PAI-1) cũng tăng lên ở chuột được điều trị bằng corisin so với những con chuột nhận peptide xáo trộn (Hình E). Hơn nữa, rối loạn chức năng thận có liên quan đến sự gia tăng đáng kể những thay đổi xơ hóa ở những con chuột được điều trị bằng corisin so với những con chuột nhận được peptide xáo trộn (Hình E). 2E–I). Những phát hiện này cho thấy corisin có thể góp phần vào sự tiến triển của bệnh thận mãn tính bằng cách thúc đẩy viêm và xơ hóa ở thận.

Hình 2: Việc sử dụng corisin gây tổn thương thận cấp tính và đợt cấp của xơ hóa thận ở chuột chuyển gen TGFβ1 có tổn thương thận từ trước.
figure 2
Một kế hoạch thử nghiệm để gây tổn thương thận cấp tính ở chuột chuyển gen TGFβ1 (TG) bị rối loạn chức năng thận từ trước. Một nhóm yếu tố tăng trưởng biến đổi β1 (TGFβ1) chuột TG (TGFβ1 TG / corisin; n = 6) nhận được 5 mg/kg trọng lượng cơ thể corisin tổng hợp bằng cách tiêm vào phúc mạc hai ngày một lần trong hai tuần, và một nhóm khác (TGFβ1 TG/scr. peptide; n = 6) nhận được một liều tương tự của peptide xáo trộn theo cùng một lịch trình và lộ trình dùng. B Corisin, albumin và creatinine trong nước tiểu được đo như mô tả trong các vật liệu và phương pháp. Số lượng chuột: TGFβ1 TG / corisin, n = 6; TGFβ1 TG / scr. peptide, n = 6. Dữ liệu được trình bày dưới dạng MEAn ± SEM. Ý nghĩa thống kê được đánh giá bằng cách sử dụng ANOVA với thử nghiệm Newman-Keuls cho dữ liệu dọc và thử nghiệm t một bên không ghép đôi để so sánh giữa hai nhóm. * P < 0.05 so với tuần 0; †p = 0,02 và ‡p = 0,01 so với TGFβ1 TG / nhóm peptide xáo trộn. C Nồng độ phân tử tổn thương thận-1 (KIM-1), protein liên kết axit béo loại gan (L-FABP), nitơ urê trong máu (BUN) và creatinin được đo như mô tả trong tài liệu và phương pháp. Số lượng chuột: TGFβ1 TG / corisin, n = 6; TGFβ1 TG / scr. peptide, n = 6. Dữ liệu được trình bày dưới dạng mean ± SD. Ý nghĩa thống kê được xác định bằng cách sử dụng thử nghiệm t không ghép đôi hai mặt. D Nồng độ chemokine CXC do lipopolysaccharide gây ra (LIX / CXCL5), protein viêm đại thực bào-2 (MIP-2), interleukin-1β (IL-1β), yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu (PDGF), yếu tố mô (TF) và chất ức chế chất kích hoạt plasminogen-1 (PAI-1) được đo bằng cách sử dụng xét nghiệm miễn dịch enzyme. Dữ liệu phân phối bình thường được trình bày dưới dạng mean ± SD, trong khi dữ liệu lệch được biểu thị dưới dạng trung vị với phạm vi giữa các phần tư. Số lượng chuột: TGFβ1 TG / corisin, n = 6; TGFβ1 TG / scr. peptide, n = 6. Ý nghĩa thống kê được đánh giá bằng cách sử dụng kiểm tra t không ghép đôi hai mặt cho dữ liệu phân phối chuẩn và thử nghiệm Mann-Whitney U hai mặt cho dữ liệu sai lệch. E-I Masson’s trichrome và acid chu kỳ-Schiff nhuộm các mô thận của cả hai nhóm chuột. Xơ hóa thận được định lượng bằng phần mềm hình ảnh WinROOF. Thanh tỷ lệ cho biết 100 μm trong (D) và 50 μm trong (F). Số lượng chuột: TGFβ1 TG / corisin, n = 6; TGFβ1 TG / scr. peptide, n = 6. Dữ liệu được trình bày dưới dạng mean ± SD. Ý nghĩa thống kê được xác định bằng cách sử dụng kiểm tra t không ghép đôi hai mặt. Dữ liệu nguồn có sẵn trong tệp Dữ liệu nguồn.

Hình ảnh kích thước đầy đủ
Ức chế corisin làm giảm sự tiến triển của bệnh thận trong điều kiện tiểu đường
Xem xét sự tham gia tiềm năng của corisin trong sự tiến triển của xơ hóa thận và mối liên hệ đã được thiết lập rõ ràng của DM như một yếu tố nguy cơ gây bệnh thận tiến triển và bệnh thận giai đoạn cuối, chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng ức chế corisin có thể làm giảm xơ hóa thận trong điều kiện tiểu đường32. Để kiểm tra giả thuyết này, chúng tôi đánh giá liệu việc sử dụng kháng thể đơn dòng kháng corisin trung hòa (mAb) có thể giảm thiểu sự tiến triển của bệnh thận ở chuột TGFβ1 TG bị DM hay không. Thông qua tiêm streptozotocin, DM đã được tạo ra ở chuột TGFβ1 TG bị rối loạn chức năng thận từ trước (Hình E). 3A). Chẩn đoán DM ở các mô hình chuột được xác nhận bằng nồng độ đường huyết và kết quả xét nghiệm dung nạp glucose trong phúc mạc (Hình E). Sau khi xác nhận DM, một nhóm chuột nhận được mAb kháng corisin, trong khi một nhóm khác nhận được đối chứng IgG, được tiêm trong phúc mạc ba lần một tuần trong tám tuần. Những con chuột đã bị hy sinh vào cuối tuần thứ chín sau khi sử dụng streptozotocin. Trong suốt thời gian điều trị, các mẫu nước tiểu và huyết tương được thu thập tuần tự từ mỗi nhóm thí nghiệm. Đáng chú ý là, trong một thí nghiệm sơ bộ, mức độ xơ hóa thận đã được so sánh giữa những con chuột DM TG được điều trị bằng tiêm IgG đối chứng và nước muối vào phúc mạc, cho thấy không có sự khác biệt đáng kể và do đó hỗ trợ việc sử dụng IgG đối chứng như một đối chứng âm tính thích hợp trong thí nghiệm này (Hình bổ sung. 5).

Hình 3: Điều trị bằng kháng thể kháng corisin ức chế sự tiến triển của xơ hóa thận trong điều kiện tiểu đường.
figure 3
Một kế hoạch thử nghiệm. Chuột TGFβ1 TG tiểu đường được chia thành các nhóm sau. Một nhóm (DM TG / anticorisin) nhận được 10 mg / kg trọng lượng cơ thể của kháng corisin mAb bằng cách tiêm vào phúc mạc ba lần một tuần trong tám tuần, trong khi một nhóm khác (DM TG / IgG đối chứng) nhận được một liều tương tự của đối chứng IgG. Theo cùng một lịch trình lấy mẫu, một nhóm kiểu hoang dã (WT) (n = 4) cũng được đưa vào. B Nồng độ đường huyết trong suốt thí nghiệm, xét nghiệm dung nạp glucose trong phúc mạc (IPGTT), creatinine huyết tương, nitơ urê trong máu (BUN), tỷ lệ albumin/creatinin trong nước tiểu và nồng độ protein liên kết axit béo dạng gan (L-FABP). n = 5 đối với DM TG / IgG kiểm soát và DM TG / kháng corisin; n = 4 cho WT / SAL. Dữ liệu phân phối bình thường được trình bày dưới dạng giá trị trung bình, trong khi dữ liệu lệch được trình bày dưới dạng trung bình. Ý nghĩa thống kê được đánh giá bằng cách sử dụng ANOVA, sau đó là thử nghiệm hậu kỳ của Newman-Keuls hoặc Dunn, nếu thích hợp; Tất cả các bài kiểm tra đều có hai mặt. †p < 0,05 so với WT / SAL trong cùng một tuần. C, D Các mẫu mô thận nhúng parafin để nhuộm collagen bằng axit trichrome. n = 5 trong nhóm DM TG / nhóm IgG kiểm soát và DM TG / anticorisin, và n = 4 trong nhóm WT / SAL. Xơ hóa thận được định lượng bằng WinROOF. Thanh tỷ lệ đại diện cho 500 μm. Dữ liệu được trình bày dưới dạng mean ± SD. Ý nghĩa thống kê được đánh giá bằng cách sử dụng ANOVA và thử nghiệm Newman-Keuls; Tất cả các bài kiểm tra đều có hai mặt. E, F Các mẫu mô thận nhúng parafin để nhuộm axit tuần hoàn-Schiff (PAS). Các thanh tỷ lệ đại diện cho 50 μm. n = 5 trong nhóm DM TG / kiểm soát IgG và DM TG / anticorisin, và n = 4 trong nhóm WT / SAL. Dữ liệu được trình bày dưới dạng mean ± SD. Ý nghĩa thống kê được đánh giá bằng cách sử dụng ANOVA và thử nghiệm Newman-Keuls; Tất cả các bài kiểm tra đều có hai mặt. G, H Nồng độ chemokine 5 (LIX/CXCL5), interleukin-1β (IL-1β), matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc từ tiểu cầu (PDGF), yếu tố tăng trưởng biến đổi tổng thể và hoạt động β1 (TGFβ1), yếu tố tăng trưởng mô liên kết (CTGF) và collagen I được đo bằng các xét nghiệm miễn dịch liên kết với enzyme. n = 11 trong DM TG / IgG kiểm soát, n = 10 trong nhóm DM TG / kháng corisin và n = 4 trong nhóm WT / SAL. Dữ liệu phân phối bình thường được trình bày dưới dạng mean ± SD, trong khi dữ liệu lệch được biểu thị dưới dạng trung vị với phạm vi giữa các phần tư. Ý nghĩa thống kê được đánh giá bằng cách sử dụng ANOVA, sau đó là thử nghiệm hậu kỳ Newman-Keuls hoặc Dunn, nếu thích hợp; Tất cả các bài kiểm tra đều có hai mặt. Dữ liệu nguồn có sẵn trong tệp Dữ liệu nguồn.

Hình ảnh kích thước đầy đủ
Đến tuần thứ 12 của nghiên cứu, chuột TG được điều trị bằng mAb trung hòa kháng corisin cho thấy sự giảm đáng kể nồng độ creatinin huyết tương và nitơ urê trong máu (BUN), cùng với tỷ lệ albumin trên creatinin trong nước tiểu giảm. Nồng độ protein liên kết axit béo loại L trong nước tiểu, một dấu hiệu của tổn thương tế bào ống mềm, cũng được cải thiện đáng kể so với chuột đối chứng (Hình E). 3B). Điều trị bằng mAb trung hòa chống corisin làm giảm đáng kể sự lắng đọng ma trận ngoại bào, cũng như mức độ lưu thông của chemokin (LIX/CXCL5), các yếu tố tăng trưởng (tổng TGFβ1, TGFβ1 hoạt động, PDGF, CTGF) và collagen I (Hình E). 3C–H). Hơn nữa, những con chuột mắc bệnh tiểu đường được điều trị bằng mAb kháng corisin cho thấy sự lắng đọng corisin ở thận giảm đáng kể (Hình bổ sung. 6A, B; Hình bổ sung. 7A, B; Hình bổ sung. 8A, B), kèm theo giảm quá trình chết rụng ở cả tế bào biểu mô cầu thận và hình ống (Hình bổ sung). 9A, B). Phù hợp với các báo cáo trước đây xác định đại thực bào là chất trung gian của tổn thương mô, xơ hóa và suy giảm chức năng trong bệnh thận mãn tính do tiểu đường (CKD)33,34, chúng tôi quan sát thấy sự thâm nhiễm đại thực bào tăng lên ở chuột mắc bệnh xơ hóa thận, giảm đáng kể ở chuột được điều trị bằng mAb kháng corisin (Hình bổ sung. 9C, D). Nhìn chung, những phát hiện này cho thấy corisin góp phần gây tổn thương mô thận, viêm và suy giảm chức năng liên quan đến xơ hóa thận trong điều kiện tiểu đường.

Làm giàu Staphylococcus biểu hiện corisin trong mẫu phân từ chuột chuyển gen TGF-β1 mắc bệnh tiểu đường và tăng mức độ tuần hoàn của I-FABP2, một dấu hiệu của tổn thương biểu mô ruột, ở bệnh nhân mắc bệnh thận mạn (CKD) do tiểu đường
Sau khi xác định mức độ tuần hoàn của corisin tăng lên và vai trò của nó trong xơ hóa thận, chúng tôi tiếp theo điều tra xem nguồn tiềm năng của nó có nằm trong hệ vi sinh vật đường ruột hay không. Để đạt được mục tiêu này, chúng tôi đã sử dụng các mồi PCR được mô tả trước đó, khuếch đại có chọn lọc một đoạn DNA ~ 150 bp mã hóa các peptide proapoptotic, để phân tích các mẫu phân từ chuột WT và chuột TGFβ1 TG bị DM do STZ gây ra và xơ hóa thận. Phân tích của chúng tôi cho thấy sự phong phú đáng kể trong các loài Staphylococcus biểu hiện corisin trong các mẫu phân từ chuột TGFβ1 TG mắc bệnh tiểu đường so với chuột đối chứng (Hình bổ sung. 10A, B). Rối loạn vi sinh vật đường ruột có thể làm tăng tính thấm ruột, thúc đẩy sự chuyển vị của các sản phẩm vi sinh vật vào tuần hoàn toàn thân35. Để đánh giá tổn thương biểu mô ruột, chúng tôi đã đo mức độ lưu thông của protein liên kết axit béo đường ruột 2 (I-FABP2) và nhận thấy chúng tăng đáng kể ở bệnh nhân tiểu đường mắc CKD so với CKD không mắc bệnh tiểu đường và các đối chứng khỏe mạnh (Hình bổ sung. 10C). Những phát hiện này cho thấy rằng trong điều kiện bệnh tiểu đường, tăng tính thấm ruột và rối loạn vi sinh vật làm tăng sự giải phóng corisin toàn thân, cho thấy rằng tăng cường sản xuất góp phần làm tăng mức độ tuần hoàn.

Mô phỏng động lực học phân tử dự đoán tương tác corisin với albumin huyết thanh của con người
Sau khi chứng minh rằng corisin có thể liên quan đến sự phát triển của bệnh thận tiểu đường, chúng tôi đã khám phá cách corisin có nguồn gốc từ hệ vi sinh vật nhắm mục tiêu vào thận. Albumin huyết thanh được biết đến với vai trò là chất mang các chất nội sinh khác nhau, bao gồm cả những chất từ hệ vi sinh vật, chẳng hạn như axit béo chuỗi ngắn và dẫn xuất indole36. Chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng corisin tương tác với albumin huyết thanh để đến thận và góp phần vào cơ chế bệnh sinh của bệnh thận. Để thẩm vấn giả thuyết này, chúng tôi đã tiến hành mô phỏng động lực học phân tử để phân tích sự tương tác giữa corisin và albumin huyết thanh của người và albumin huyết thanh của bò. Albumin huyết thanh của người bao gồm một chuỗi polypeptide duy nhất chứa 585 dư lượng axit amin, được tổ chức thành ba miền xoắn ốc α được dán nhãn I, II và III36,37,38. Trình tự axit amin của albumin người thể hiện mức độ tương đồng cao với albumin bò, chia sẻ 77,5% nhận dạng39. Chúng tôi đã sử dụng AlphaFold-Multimer40 để mô hình hóa các cấu hình của corisin liên kết với albumin huyết thanh người (HSA) và albumin huyết thanh bò (BSA). Phân tích dự đoán cho thấy corisin tương tác với miền I và III của HSA, trong khi nó chủ yếu liên kết với miền II của BSA (Hình E). 4A, B). Mô phỏng động lực học phân tử 100 ns đã được tiến hành trên cả phức hợp HSA-corisin và BSA-corisin bằng cách sử dụng OpenMM41. Sau đó, năng lượng tương tác của các phức hợp này được định lượng bằng phương pháp Năng lượng tương tác tuyến tính (LIE) trong CPPTRAJ42. Kết quả cho thấy năng lượng tương tác thấp hơn đối với phức hợp HSA-corisin, với sự khác biệt đáng kể khoảng -22,3353 kcal / mol. Những phát hiện này cho thấy corisin có thể tạo thành một phức hợp ổn định với albumin huyết thanh của con người, cho thấy rằng, giống như các chất chuyển hóa có nguồn gốc từ hệ vi sinh vật khác, albumin có thể đóng vai trò là chất mang corisin đến các cơ quan ở xa, bao gồm cả thận.

Hình 4: Corisin tương tác với albumin huyết thanh của con người.
figure 4
A, B Cấu trúc tương tác dự đoán của albumin-corisin huyết thanh người và albumin-corisin huyết thanh bò bằng mô phỏng động học phân tử. Albumin huyết thanh của người và albumin huyết thanh bò được thể hiện dưới dạng biểu diễn bề mặt, và các miền I, II và III lần lượt được hiển thị bằng màu hồng, vàng và xanh băng. Corisin được thể hiện trong đại diện cam thảo. C, D Western blotting cho thấy sự tương tác của corisin với albumin người tái tổ hợp (rhAlb) trong ống nghiệm. Nồng độ cố định của rhAlb được kết hợp với nồng độ corisin tổng hợp hoặc peptide xáo trộn và ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Hỗn hợp đã trải qua quá trình điện di gel natri dodecyl-sulfate polyacrylamide (SDS-PAGE), sau đó là Western blotting sử dụng kháng thể đơn dòng chống corisin (mAb) hoặc kháng thể chống rhAlb. Thí nghiệm được lặp lại độc lập ba lần với kết quả tương tự. E Đồng kết tủa miễn dịch của corisin với rhAlb. Corisin tổng hợp được ủ với rhAlb, được xử lý bằng mAb chống corisin và kết tủa miễn dịch bằng cách sử dụng hạt protein G agarose. rhAlb không được kết tủa miễn dịch bởi các hạt agarose kháng corisin mAb và protein G (làn 5). Với sự hiện diện của corisin, rhAlb đã đồng kết tủa miễn dịch thành công bởi các hạt agarose kháng corisin mAb và protein G (làn 6). Thí nghiệm được lặp lại độc lập ba lần với kết quả tương tự. Ig, globulin miễn dịch; MW, trọng lượng phân tử. F Corisin tương tác với albumin huyết thanh của người và chuột. Nồng độ albumin huyết thanh người (HSA) hoặc albumin huyết thanh chuột (MSA) được ủ với corisin tổng hợp. Hỗn hợp được thực hiện SDS-PAGE và Western blotting bằng cách sử dụng kháng thể đơn dòng chống corisin. Thí nghiệm được lặp lại độc lập ba lần với kết quả tương tự. G Corisin tương tác với albumin huyết thanh của người có nguồn gốc từ cả bệnh nhân mắc bệnh thận tiểu đường và những người khỏe mạnh. Các mẫu huyết thanh được pha loãng (1:20) và ủ trong 10 phút với corisin (4 μg) pha loãng trong nước muối. Đối chứng, một hỗn hợp có chứa corisin (4 μg) và rhAlb (5 μg) đã được chuẩn bị. Mỗi hỗn hợp sau đó được điện di, sau đó là phân tích Western blot sử dụng mAb đặc hiệu cho corisin hoặc albumin người. Thí nghiệm được lặp lại độc lập ba lần với kết quả tương tự. H, tôi Sự hình thành phức hợp giữa corisin và albumin trong nước tiểu của bệnh nhân thận mạn đái tháo đường. Mẫu nước tiểu từ 3 bệnh nhân tiểu đường mắc bệnh thận mãn tính (CKD) và 3 đối tượng khỏe mạnh được cô đặc 5 lần, và 5 μL mỗi mẫu được thực hiện SDS-PAGE, sau đó là Western blotting bằng cách sử dụng kháng corisin mAb (bảng bên trái) hoặc kháng thể albumin kháng người (bảng bên phải). DM đái tháo đường.

Hình ảnh kích thước đầy đủ
Xác nhận thực nghiệm tương tác albumin huyết thanh corisin-người
Chúng tôi đã tiến hành Western blotting để xác nhận phân tích tính toán cho thấy sự tương tác của corisin với albumin huyết thanh của con người. Các nồng độ corisin tổng hợp khác nhau hoặc peptide xáo trộn của nó được ủ với nồng độ albumin huyết thanh người tái tổ hợp (rhAlb) xác định ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Sau đó, các hỗn hợp được điện di và thấm phương Tây bằng cách sử dụng mAb kháng corisin. Các mẫu có chứa corisin và rhAlb cho thấy nhiều dải ở khoảng 35, 46, 50 và 69 kDa, với cường độ dải tăng tỷ lệ thuận với nồng độ corisin, cho thấy sự đồng định vị và tương tác của corisin với albumin của người (Hình E). 4C). Ngược lại, không có dải nào được quan sát thấy trong các mẫu có chứa peptide xáo trộn. Tước màng sau đó điều trị bằng kháng thể albumin kháng người cho thấy các dải cường độ đồng đều trên tất cả các làn (Hình E). 4D).

Để xác nhận sự đồng định vị của corisin tổng hợp với albumin huyết thanh tái tổ hợp của người trong quá trình điện di, chúng tôi đã tiến hành khối phổ. Một lượng corisin tổng hợp cụ thể được hòa tan trong 0,5% rhAlb hoặc nước muối sinh lý và ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Các mẫu sau đó được điện di, sau đó nhuộm màu xanh Coomassie (Hình bổ sung. 11). Các dải nhuộm màu tương ứng với 35 kDa đã được cắt bỏ, và trình tự của protein và peptide được phân tích bằng phép đo khối phổ. Chúng tôi đã so sánh các protein và peptide có trong gel chứa albumin của người, có hoặc không có corisin. Kết quả, bao gồm danh sách các protein và peptide được xác định, được trình bày trong Bộ dữ liệu bổ sung 2. Phân tích khối phổ cho thấy corisin cùng tồn tại với albumin của người trong gel chứa cả albumin và corisin, trong khi corisin không có trong gel chỉ chứa albumin. Những quan sát này hỗ trợ thêm sự đồng định vị và tương tác của corisin với albumin người.

Chúng tôi đã tiến hành một xét nghiệm kết tủa miễn dịch để chứng thực thêm sự hình thành phức hợp giữa corisin và albumin của con người. Albumin người tái tổ hợp và corisin tổng hợp được trộn và ủ ở 37 °C trong 30 phút. Sau đó, anticorisin mAb được thêm vào hỗn hợp phản ứng và ủ ở 4 °C trong 30 phút. Sau đó, các hạt protein G agarose được thêm vào hỗn hợp và ủ thêm. Sau khi rửa kỹ các hạt agarose protein G, các protein kết tủa được rửa giải bằng cách thêm dung dịch đệm nạp natri dodecyl sulfat và ly tâm. Phần nổi của protein đã rửa giải được điện di gel và nhuộm màu xanh Coomassie. Kết quả đã chứng minh sự đồng kết tủa của corisin với albumin của người (Hình E). 4E, làn 6), cung cấp thêm bằng chứng về sự tương tác và hình thành phức tạp giữa corisin và albumin người.

Chúng tôi cũng đã chứng minh thông qua Western blotting rằng peptide corisin tương tác với albumin huyết thanh của người và chuột từ nguồn thương mại và với albumin huyết thanh từ bệnh nhân mắc bệnh thận tiểu đường và các đối tượng khỏe mạnh (Hình E). 4F, G), độc lập với điều kiện pH (Hình bổ sung. 12A, B). Ngoài ra, phát hiện của chúng tôi chỉ ra rằng phần lớn corisin trong huyết thanh tồn tại ở dạng liên kết, với corisin tự do gần như không thể phát hiện được (Hình bổ sung. 13). Nhìn chung, kết quả của các thí nghiệm xác nhận này ủng hộ mạnh mẽ sự tương tác phân tử giữa albumin và corisin, cho thấy vai trò tiềm năng của albumin trong việc tạo điều kiện thuận lợi cho việc vận chuyển corisin đến các cơ quan ngoại biên. Quan sát này có thể có ý nghĩa quan trọng để hiểu các cơ chế mà corisin có nguồn gốc từ hệ vi sinh vật ảnh hưởng đến các mô ở xa và góp phần vào cơ chế bệnh sinh bệnh.

Tăng cường hoạt động proapoptotic của corisin trong dung dịch giàu albumin ở người
Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng cấu trúc cấu hình, tính ổn định và tính chất chức năng của peptide có thể được tăng cường đáng kể thông qua sự hình thành phức hợp với albumin 43,44,45,46,47,48. Dựa trên những phát hiện này và với quan sát của chúng tôi rằng corisin tương tác với albumin của con người, chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng corisin tổng hợp không ổn định về cấu trúc khi cô lập trong dung dịch. Chúng tôi đề xuất thêm rằng sự tương tác của nó với albumin của con người cải thiện cấu trúc của corisin, do đó tăng cường sự ổn định và hoạt động chức năng của nó. Để xác nhận giả thuyết này, chúng tôi đã sử dụng mô phỏng động lực học phân tử để kiểm tra các mô hình gấp của corisin tổng hợp trong dung dịch, bắt đầu từ cả trạng thái gấp và mở tự nhiên. Sử dụng các mô hình trạng thái Markov, chúng tôi đã nắm bắt được nhiệt động lực học và động học của các trạng thái gấp riêng biệt, với kết quả là cảnh quan năng lượng tự do (Hình bổ sung). 14A) phân định các rào cản năng lượng giữa các trạng thái cấu trúc khác nhau của peptide.

Chúng tôi tập trung vào xoắn α duy nhất có mặt giữa Val2 và Ser6 trong cấu trúc tự nhiên, sử dụng khoảng cách giữa các dư lượng này, khoảng 3,2 Å trong peptide tự nhiên, như một thước đo quan trọng để theo dõi tiến trình gấp. Ngoài ra, tỷ lệ liên hệ bản địa được sử dụng như một thước đo quan trọng khác. Cùng với nhau, cả khoảng cách giữa các dư lượng và phần tiếp xúc tự nhiên đều cung cấp một mô tả toàn diện về bối cảnh năng lượng không gấp của peptide. Chúng tôi quan sát thấy ba cực nhỏ trong cảnh quan, mỗi điểm đại diện cho các trạng thái cấu trúc riêng biệt (Hình bổ sung. 14B). Ở trạng thái 1, peptide thể hiện một phần cao các tiếp xúc tự nhiên, khoảng 0,78, với khoảng cách Val2-Ser6 xấp xỉ 3 Å. Ở trạng thái 2, trong khi xoắn α duy nhất vẫn ổn định, các phần peptide khác mất tiếp xúc tự nhiên. Ở trạng thái 3, peptide mất hoàn toàn cấu trúc xoắn α. Quan sát này cũng cung cấp thông tin chi tiết về quá trình chuyển đổi động học trên ba trạng thái này, chỉ ra rằng việc đạt đến trạng thái 1, được đặc trưng bởi tỷ lệ tương tác cao giống với cấu trúc gốc, cần một thời gian dài hơn đáng kể. Những kết quả này hỗ trợ giả thuyết của chúng tôi rằng chỉ riêng corisin tổng hợp bị suy giảm trong việc áp dụng cấu trúc tự nhiên của nó trong dung dịch.

Các nghiên cứu sâu hơn bao gồm mô phỏng động lực học phân tử 150 nano giây để đánh giá xem corisin có trải qua những thay đổi cấu trúc khi tương tác với albumin huyết thanh của con người hay không. Độ lệch trung bình bình phương gốc (RMSD) của corisin so với cấu trúc tự nhiên của nó, vượt quá 2 Ångstroms trong quá trình tương tác này, cho thấy những thay đổi cấu trúc đáng kể (Hình bổ sung. 14C). Các thí nghiệm tiếp theo đã kiểm tra xem liệu tương tác này có làm tăng hiệu quả proapoptotic của corisin tổng hợp hay không. Chúng tôi nuôi cấy các tế bào biểu mô ống gần thận bình thường ở các nồng độ corisin khác nhau pha loãng trong albumin huyết thanh người tái tổ hợp 0,5% lơ lửng trong nước muối và so sánh chúng với các tế bào được nuôi cấy ở nồng độ corisin tương đương trong nước muối. Kết quả cho thấy corisin pha loãng trong 0,5% albumin tái tổ hợp ở người gây ra quá trình chết rụng theo cách phụ thuộc vào liều, với tỷ lệ tế bào apoptotic cao hơn đáng kể so với những tế bào được điều trị bằng nước muối đơn thuần (Hình bổ sung. 15A, B). Kết quả tương tự đã được quan sát thấy ở các tế bào biểu mô hình ống Caki-2 ở người và tế bào chân bình thường của người được kích thích bằng corisin khi có hoặc không có albumin tái tổ hợp 0,5% ở người. Phân tích tế bào dòng so sánh cho thấy corisin trong albumin tái tổ hợp 0,5% ở người làm tăng đáng kể tỷ lệ tế bào Caki-2 và tế bào poto so với những tế bào được điều trị bằng corisin trong nước muối (Hình bổ sung. 15C–F). Những phát hiện này cho thấy hoạt động proapoptotic của corisin được tăng cường đáng kể khi có albumin của con người, có thể là do sự tương tác và hình thành phức tạp giữa corisin và albumin của con người. Dựa trên những quan sát này, sau đó chúng tôi đã sử dụng corisin pha loãng trong dung dịch albumin của người cho các nghiên cứu in vitro của chúng tôi.

Ngoài ra, tác dụng của corisin trong 0,5% rhAlb đối với sự biểu hiện của các yếu tố chống apoptotic đã được đánh giá. Corisin trong rhAlb làm giảm đáng kể sự biểu hiện của Bcl-2, Bcl-xL, chất ức chế apoptosis 2 (cIAP2) và survivin trong các tế bào biểu mô ống thận nguyên phát ở người, một tác dụng đã được đảo ngược bằng cách đồng điều trị chống corisin mAb (Hình bổ sung 16A, B). Hơn nữa, phân tích chu kỳ tế bào của cả tế bào chân sơ sinh ở người và tế bào biểu mô ống sơ sinh của thận đã chứng minh rằng corisin trong 0,5% rhAlb, làm tăng đáng kể quần thể dưới G1 và G1 trong khi giảm quần thể giai đoạn S (Hình bổ sung. 17A–D). Những thay đổi này đã được cải thiện bằng cách đồng điều trị với kháng thể đơn dòng chống corisin. Phù hợp với những phát hiện này, cả sự tăng sinh và tốc độ tăng sinh tế bào đều giảm đáng kể sau khi tiếp xúc với corisin (Hình bổ sung. 17E, F). Những phát hiện này chỉ ra rằng corisin làm suy giảm sự tiến triển và tăng sinh của chu kỳ tế bào trong khi thúc đẩy quá trình chết rụng ở các tế bào biểu mô thận.

Sự hình thành phức hợp giữa corisin và albumin trong nước tiểu của bệnh nhân thận mạn tiểu đường
Việc chứng minh rằng corisin tương tác với albumin của người và sự tương tác này làm tăng khả năng tổn thương tế bào của nó đã thúc đẩy giả thuyết rằng corisin tạo thành phức hợp với albumin trong nước tiểu của những bệnh nhân có biểu hiện albuminuria. Để kiểm tra giả thuyết này, các mẫu nước tiểu từ bệnh nhân mắc bệnh thận mạn do tiểu đường và từ các đối chứng khỏe mạnh đã được điện di, sau đó là phân tích Western blot sử dụng kháng thể đơn dòng chống lại corisin và albumin người. Sự phân mảnh và phức hợp polyme của albumin đã được báo cáo trong nước tiểu của bệnh nhân DM49,50. Kết quả Western blot cho thấy các dải vượt quá 60 kDa và 40 kDa trong tất cả các mẫu nước tiểu từ bệnh nhân mắc bệnh thận tiểu đường nhưng không có dải nào trong mẫu từ các đối chứng khỏe mạnh (Hình E). 4H, I). Những phát hiện này cho thấy corisin thực sự phức tạp với albumin trong nước tiểu của bệnh nhân bị albuminuria, có khả năng làm trung gian các tác dụng phụ liên quan đến albuminuria 51,52,53.

Corisin thâm nhập vào các tế bào thận thông qua thụ thể albumin cubilin để nhắm mục tiêu vào ty thể
Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng corisin đặc biệt nhắm mục tiêu vào ty thể27,29. Sau khi xác định rằng corisin tương tác với albumin của con người, chúng tôi đã điều tra xem liệu corisin có thâm nhập vào tế bào thận thông qua các thụ thể albumin để nhắm mục tiêu vào ty thể hay không. Chúng tôi tập trung vào các tế bào biểu mô ống thận và tế bào chân, vì các loại tế bào này, không giống như tế bào trung thất, biểu hiện các thụ thể albumin. Ban đầu, chúng tôi nuôi cấy các tế bào biểu mô thận dạng ống Caki-2 và tế bào podocytes chính của người với corisin được dán nhãn fluorescein isothiocyanate (FITC) hoặc một peptide xáo trộn được dán nhãn FITC hòa tan trong 0,5% albumin người. Sau khi bổ sung một máy theo dõi Mito, chúng tôi đã đánh giá những thay đổi trong nhuộm ty thể. Các tế bào được xử lý bằng corisin được dán nhãn FITC thể hiện màu kép màu xanh lá cây và đỏ, cho thấy việc nhắm mục tiêu ty thể bằng corisin, không giống như những tế bào được xử lý bằng peptide xáo trộn (Hình E). 5A–D).

Hình 5: Corisin thâm nhập vào các tế bào thận thông qua thụ thể albumin ở người cubilin để nhắm mục tiêu ty thể.
figure 5
A–D, các dòng tế bào Caki-2 của người và tế bào podocytes nguyên phát bình thường của người được nuôi cấy đến gần hợp lưu, sau đó xử lý bằng corisin được dán nhãn fluorescein isothiocyanate (FITC) (corisin-FITC) hoặc peptide xáo trộn được dán nhãn FITC trong 4 giờ. MitoTracker được thêm vào 30 phút trước khi cố định để dán nhãn ty thể, và các tế bào sau đó được chụp ảnh qua kính hiển vi. Cường độ huỳnh quang của F-actin và DAPI được định lượng bằng ImageJ. Thanh tỷ lệ đại diện cho 20 μm. n = 8 lần lặp lại. Dữ liệu được trình bày dưới dạng mean ± SD. Phân tích thống kê được thực hiện bằng cách sử dụng kiểm tra t không ghép đôi hai mặt. E–G, Tế bào podocytes nguyên phát bình thường của người được nuôi cấy trong 48 giờ với siRNA nhắm mục tiêu CD36, megalin, cubilin, SPARC và FCGRT, và đánh giá biểu hiện tương đối của các thụ thể albumin. n = 4 lần lặp lại. Dữ liệu được biểu thị dưới dạng mean ± SD. So sánh thống kê giữa mỗi siRNA đặc hiệu thụ thể và siRNA đối chứng tương ứng của nó được thực hiện bằng cách sử dụng thử nghiệm t không ghép đôi hai mặt. Trong một thí nghiệm riêng biệt, các tế bào được nuôi cấy trong các điều kiện tương tự và sau đó được xử lý bằng corisin-FITC, MitoTracker và DAPI và quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang. Cường độ huỳnh quang của F-actin và DAPI được định lượng bằng cách sử dụng ImageJ, một phần mềm mã nguồn mở của Viện Y tế Quốc gia (NIH). Thanh tỷ lệ đại diện cho 20 μm. n = 8 lần lặp lại. n = 12 trong nhóm kiểm soát và n = 6 trong các nhóm còn lại. Dữ liệu được trình bày dưới dạng mean ± SD. Phân tích thống kê được thực hiện bằng cách sử dụng ANOVA sau đó là thử nghiệm Dunnett; Tất cả các bài kiểm tra đều có hai mặt. Dữ liệu nguồn có sẵn trong tệp Dữ liệu nguồn.

Hình ảnh kích thước đầy đủ
Sau đó, chúng tôi đã xử lý trước các tế bào chân ở người bằng RNA can thiệp nhỏ (siRNA) nhắm mục tiêu vào một số thụ thể albumin, bao gồm cubilin, megalin, CD36, SPARC (protein tiết ra axit và giàu cysteine) và thụ thể Fc sơ sinh (FcRn), được mã hóa bởi gen FCGRT. Sau khi tiếp xúc với corisin được dán nhãn FITC hòa tan trong 0,5% albumin người, chúng tôi quan sát thấy sự ức chế đáng kể biểu hiện mRNA đối với tất cả các thụ thể albumin đã được thử nghiệm bởi siRNA tương ứng của chúng. Tuy nhiên, chỉ có quá trình tiền xử lý bằng siRNA cubilin đã ngăn chặn đáng kể việc nhắm mục tiêu ty thể bằng corisin (Hình E). 5E–G). Những kết quả này cho thấy rằng thụ thể albumin cubilin làm trung gian cho sự xâm nhập của corisin vào tế bào để nhắm mục tiêu cụ thể vào ty thể.

Sự xâm nhập tế bào của corisin khi không có albumin của con người
Để điều tra xem corisin có thể xâm nhập vào tế bào độc lập với albumin hay không, các tế bào biểu mô hình ống thận nguyên phát bình thường được nuôi cấy với sự hiện diện của corisin-FITC pha loãng trong albumin người tái tổ hợp 0,5% (rhAlb) hoặc nước muối. Sự hấp thu corisin nội bào đã được theo dõi và định lượng. Kết quả chứng minh rằng corisin có thể xâm nhập một phần vào tế bào ngay cả khi không có albumin, cho thấy sự tồn tại của các cơ chế thay thế để xâm nhập tế bào (Hình bổ sung. 18A, B). Những phát hiện này chỉ ra rằng quá trình nội hóa corisin có thể không chỉ phụ thuộc vào liên kết albumin và làm tăng khả năng các cơ chế thay thế, chẳng hạn như nội bào, có thể góp phần vào sự hấp thu tế bào của nó. Cần nghiên cứu thêm để làm sáng tỏ các con đường chính xác liên quan.

Corisin gây ra sự lão hóa của các tế bào thận nhu mô để đẩy nhanh quá trình xơ hóa thận
Sau khi làm sáng tỏ cách corisin nhắm mục tiêu vào các mô thận và thâm nhập vào tế bào thận, chúng tôi đã điều tra cơ chế tiềm năng mà corisin có thể tham gia vào sự tiến triển của xơ hóa thận. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng corisin làm trầm trọng thêm tình trạng xơ phổi và tổn thương phổi cấp tính bằng cách gây ra quá trình apoptosis qua trung gian ty thể trong các tế bào biểu mô phế nang và thúc đẩy phản ứng viêm27,29,54. Hơn nữa, nghiên cứu hiện tại đã tóm tắt hoạt động apoptotic của corisin trên tế bào podocyte bình thường của người và tế bào biểu mô hình ống thận (Hình bổ sung. 15A–F), như đã báo cáo trước đây28. Chết tế bào rối loạn chức năng phá vỡ hàng rào lọc cầu thận và tính toàn vẹn của ống thận, dẫn đến protein niệu, giảm tốc độ lọc cầu thận (GFR) và rối loạn chức năng ống thận55,56. Do đó, hoạt tính apoptotic của corisin trên các tế bào nhu mô thận cũng có thể là một yếu tố đóng góp quan trọng vào cơ chế bệnh sinh của bệnh thận.

Điều quan trọng là, rối loạn điều hòa apoptosis có liên quan chặt chẽ đến sự lão hóa và sự phát triển của các bệnh liên quan đến tuổi tác, bao gồm xơ thận57,58. Khi sinh vật già đi, sự tích tụ tổn thương tế bào và stress oxy hóa dẫn đến tăng hoạt động apoptotic, góp phần vào thoái hóa mô và suy giảm chức năng57,58. Nghiên cứu trước đây của chúng tôi đã chứng minh rằng quá trình apoptosis do corisin gây ra có liên quan đến việc kích hoạt con đường apoptotic ty thể nội tại và tăng sản xuất các loại oxy phản ứng28,29. Dựa trên những quan sát trên, chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng quá trình apoptosis liên quan đến corisin là một phần của quá trình lão hóa do corisin gây ra trong quá trình xơ thận. Để kiểm tra giả thuyết này, chúng tôi đã điều trị tế bào podocytes nguyên phát ở người và tế bào biểu mô hình ống thận của người bằng corisin và đánh giá hoạt động của β-galactosidase (SAβGal) liên quan đến lão hóa, một dấu hiệu lão hóa và biểu hiện mRNA của các dấu hiệu lão hóa, trongbao gồm protein khối u p53 (TP53, p53), Ki-67 (MKI67) và các chất ức chế kinase phụ thuộc cyclin CDKN2B (p15), CDKN2A (p16), CDKN1A (p21) và CDKN1B (p27)59,60. Ngoài ra, chúng tôi đã đánh giá các thành phần của kiểu hình bài tiết liên quan đến lão hóa (SASP), chẳng hạn như ma trận metalloproteinase-12 (MMP-12) và osteopontin (SPP1)59,60.

Corisin đã tăng cường đáng kể hoạt động của SAβGal trong tế bào chân nguyên phát của con người, tế bào biểu mô ống ống nguyên phát của thận ở người và dòng tế bào biểu mô ống Caki-2 so với đối chứng. Hoạt động tăng cường này đã bị đảo ngược đáng kể bằng cách nuôi cấy các tế bào với sự hiện diện của anticorisin mAb21A (Hình E). 6A–F). Sự biểu hiện của các dấu hiệu lão hóa p16, p21, p27, p53 và SPP1 đã tăng đáng kể bởi corisin ở cả tế bào chân người và tế bào biểu mô ống thận so với tế bào đối chứng. Ngược lại, biểu hiện Ki-67 bị giảm đáng kể bởi corisin ở cả hai loại tế bào. So với đối chứng, biểu hiện mRNA tương đối của MMP-12 đã tăng lên đáng kể bằng cách điều trị corisin trong tế bào chân nhưng không tăng trong tế bào biểu mô hình ống (Hình E). 6G, H). Tác dụng của corisin đối với biểu hiện mRNA của p21, p27, p53 và SPP1 đã bị chặn đáng kể bằng cách xử lý các tế bào bằng anticorisin mAb. Tương tự, ảnh hưởng của corisin đối với biểu hiện mRNA tương đối của Ki-67 bị ức chế đáng kể trong các tế bào biểu mô ống thận ở người khi có sự hiện diện của anticorisin mAb (Hình E). 6G, H). Hình thái hạt nhân bất thường là một dấu hiệu của các tế bào lão hóa61. Cùng với điều này, tế bào podocytes nguyên sinh của con người và các tế bào biểu mô ống sơ sinh của thận được nuôi cấy với sự hiện diện của corisin cho thấy diện tích hạt nhân tăng lên, chu vi hạt nhân và giảm độ tuần hoàn so với đối chứng. Đáng chú ý, những bất thường hạt nhân này đã được cải thiện đáng kể bằng cách điều trị bằng mAb kháng corisin (Hình bổ sung. 19A, B; Hình bổ sung. 20A, B). Chúng tôi cũng đánh giá biểu hiện của p21 (Hình E). 6I, J), và p53 (Hình bổ sung. 21A, B) ở chuột TGFβ1 TG tiểu đường bị xơ hóa thận bằng hóa mô miễn dịch và phát hiện ra rằng corisin gây ra biểu hiện protein tăng cường ở chuột tiểu đường bị xơ hóa thận so với chuột đối tác được điều trị bằng kháng corisin mAb. Nhìn chung, những quan sát này chỉ ra rằng cảm ứng lão hóa liên quan đến corisin trong các tế bào nhu mô thận có thể đóng một vai trò thiết yếu trong sự tiến triển của xơ hóa thận.

Hình 6: Corisin gây ra sự biểu hiện tăng của các dấu hiệu lão hóa trong tế bào thận.
figure 6
A–F Cảm ứng hoạt động β-galactosidase (SAβGal) liên quan đến lão hóa bằng corisin. Tế bào Caki-2 ở người (bảng bên trái), tế bào biểu mô ống thận nguyên phát ở người (bảng giữa) và tế bào chân nguyên phát bình thường ở người (bảng bên phải) được nuôi cấy khi không có hoặc có 20 hoặc 40 μg/mL corisin, pha loãng trong albumin tái tổ hợp 0,5% ở người (rhAlb), hoặc 40 μg/mL corisin với kháng thể kháng corisin. Hoạt động SAβGal đã được đo và các tế bào dương tính với %SAβGal được đếm trên nhiều trường công suất cao bằng kính hiển vi miễn dịch huỳnh quang. Thanh tỷ lệ đại diện cho 50 μm. Kiểm soát, n = 6; corisin (20 μg / mL), n = 6; corisin (40 μg / mL), n = 6; corisin (40 μg / mL) + kháng corisin (200 μg / mL), n = 6. Dữ liệu được biểu thị dưới dạng mean ± SD. Phân tích thống kê bằng ANOVA sau đó là thử nghiệm Newman-Keuls; Tất cả các bài kiểm tra đều có hai mặt. G–H Tăng biểu hiện mRNA của các yếu tố liên quan đến lão hóa trong tế bào thận bằng corisin. Tế bào chân bình thường của người (n = 6) và tế bào biểu mô ống sơ sinh của người bình thường (n = 5) được nuôi cấy khi không có hoặc có corisin 20 và 40 μg / mL, pha loãng trong albumin người tái tổ hợp 0,5% hoặc 40 μg / mL corisin với kháng thể chống corisin trong 48 giờ. mức độ biểu hiện mRNA của chất ức chế kinase phụ thuộc cyclin p15 (CDKN2), p16 (CDKN2A), p21 (CDKN1A), p27 (CDKN1B), p53 (TP53), Ki-67 (MKI67), matrix metalloproteinase-12 (MMP12) và phosphoprotein tiết ra 1 (SPP1, còn được gọi là osteopontin) đã được đánh giá bằng RT-PCR. Dữ liệu phân phối bình thường được trình bày dưới dạng mean ± SD, trong khi dữ liệu lệch được biểu thị dưới dạng trung vị với phạm vi liên phần tư. Ý nghĩa thống kê được đánh giá bằng cách sử dụng ANOVA với thử nghiệm Newman-Keuls hoặc Dunn; Tất cả các bài kiểm tra đều có hai mặt. Tôi, J Kháng thể kháng corisin ức chế sự biểu hiện của các dấu hiệu lão hóa. Đái tháo đường (DM) được gây ra trong chuột chuyển đổi gen (TG) yếu tố tăng trưởng β1 (TGFβ1) bằng streptozotocin. Những con chuột được chia thành nhóm DM TG / nhóm IgG đối chứng (n = 5) và nhóm DM TG / anticorisin (n = 5). Chuột loại hoang dã (WT) được tiêm nước muối trong phúc mạc (SAL, n = 4) đóng vai trò là đối chứng. Các phần mô thận nhúng parafin được chuẩn bị để nhuộm miễn dịch huỳnh quang p21. Tín hiệu miễn dịch huỳnh quang màu xanh lá cây (mũi tên màu đỏ) cho biết biểu hiện p21. Khu vực dương tính với p21 được định lượng bằng cách sử dụng WinROOF. Thanh tỷ lệ đại diện cho 100 μm. Dữ liệu được trình bày dưới dạng mean ± SD. Ý nghĩa thống kê được đánh giá bằng ANOVA sau đó là thử nghiệm Newman-Keuls; Tất cả các bài kiểm tra đều có hai mặt. Dữ liệu nguồn có sẵn trong tệp Dữ liệu nguồn.

Hình ảnh kích thước đầy đủ
Tăng cường biểu hiện corisin và p21 trong mô thận từ bệnh nhân CKD
Nghiên cứu trước đây đã chứng minh rằng biểu hiện p21 vẫn tăng cao trong mô thận của bệnh nhân CKD, ngay cả sau khi cải thiện lượng đường trong máu62. Sự tăng cao dai dẳng này có liên quan đến mức độ nghiêm trọng của bệnh thận do tiểu đường và đóng vai trò như một dấu hiệu của tổn thương thận kéo dài62. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã đánh giá sự hiện diện của corisin, tế bào apoptotic và biểu hiện p21 trong mô thận từ bệnh nhân CKD bằng cách sử dụng hóa mô miễn dịch và so sánh nó với mô thận bình thường. Phù hợp với các quan sát của chúng tôi trong các mô hình chuột của chuột TGFβ1 TG mắc bệnh xơ hóa thận, nhuộm miễn dịch corisin, các dấu hiệu lão hóa p21 và tế bào apoptotic đã tăng đáng kể trong mô thận từ bệnh nhân CKD so với mô đối chứng (Hình bổ sung. 22A, B). Những phát hiện này hỗ trợ thêm sự liên quan tịnh tiến của kết quả mô hình chuột của chúng tôi đối với bệnh ở người.

Corisin gây ra sự chuyển đổi biểu mô-trung mô trong tế bào nhu mô thận
Với dữ liệu trên cho thấy sự tham gia tiềm năng của corisin trong quá trình lão hóa, kiến thức chung rằng lão hóa và chuyển đổi biểu mô-trung mô (EMT) chia sẻ các con đường điều hòa chung trong xơ hóa, vai trò của EMT trong việc tạo điều kiện cho các tế bào thoát khỏi lão hóa và ảnh hưởng của SASP đối với tái tạo mô và xơ hóa, chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng corisin cũng có thể gây ra EMT trong các tế bào nhu mô thận63, 64,65. Để kiểm tra giả thuyết này, chúng tôi đã nuôi cấy tế bào chân nguyên phát của người và các tế bào biểu mô ống gần thận ở người với sự hiện diện của corisin và đánh giá các dấu hiệu của EMT. Tế bào chân và tế bào biểu mô ống gần thận ở người được nuôi cấy bằng corisin cho thấy hình thái hình trục chính với nhuộm actin dạng sợi được tăng cường đáng kể so với các tế bào đối chứng. Ngoài ra, cường độ của actin dạng sợi đã giảm đáng kể trong các tế bào được xử lý bằng corisin cộng với mAb anticorisin (Hình E). 7A–D). Biểu hiện mRNA của actin cơ trơn α (α-SMA), fibronectin và collagen I đã tăng đáng kể bởi corisin ở cả tế bào chân và tế bào biểu mô ống thận so với đối chứng. Chống corisin mAb ức chế đáng kể sự gia tăng biểu hiện của α-SMA và fibronectin trong tế bào podocy, cũng như α-SMA, fibronectin và collagen I trong tế bào biểu mô ống thận. Hơn nữa, biểu hiện mRNA của TGFβ1 đã tăng lên đáng kể ở các tế bào chân được điều trị bằng corisin, nhưng tác dụng này đã giảm đáng kể bởi mAb chống corisin (Hình E). 7E, F). Những kết quả này cho thấy rằng corisin có thể trực tiếp thúc đẩy quá trình hình thành xơ hóa bằng cách gây ra EMT trong các tế bào nhu mô thận.

Hình 7: Corisin gây ra sự chuyển đổi biểu mô-trung mô trong tế bào chân và tế bào biểu mô ống thận.
figure 7
A–D Tế bào podocytes nguyên phát bình thường của người hoặc tế bào biểu mô ống gần thận nguyên phát (RPTEC) được nuôi cấy trong 48 giờ trong điều kiện không có corisin (môi trường chứa 0,5% albumin tái tổ hợp của người) và với corisin ở nồng độ 20 và 40 μg / mL, hòa tan trong albumin người tái tổ hợp 0,5% hoặc 40 μg / mL corisin với kháng thể chống corisin. Sau đó, các tế bào được nhuộm bằng Phalloidin-iFluor™ 488 và 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Cường độ huỳnh quang của F-actin và số lượng tế bào được định lượng bằng ImageJ, một phần mềm phạm vi công cộng của Viện Y tế Quốc gia (NIH). n = 4 trong các thí nghiệm sử dụng tế bào chân và n = 6 trong các thí nghiệm sử dụng RPTEC. Thanh tỷ lệ chỉ ra 20 μm. Dữ liệu được biểu thị dưới dạng tỷ lệ cường độ trung bình trên mỗi tế bào ± SD. Phân tích thống kê được thực hiện bằng cách sử dụng ANOVA sau đó là thử nghiệm Newman-Keuls; Tất cả các bài kiểm tra đều có hai mặt. E, F Các tế bào được nuôi cấy trong các điều kiện tương tự để thu thập tổng RNA từ mỗi nhóm điều trị và đánh giá biểu hiện mRNA của actin cơ trơn α (ACTA2), fibronectin (FN1), collagen I (COL1a1) và yếu tố tăng trưởng biến đổi β1 (TGFB1). n = 5 trong (E) và n = 6 trong (F). Dữ liệu phân phối bình thường được trình bày dưới dạng mean ± SD, trong khi dữ liệu lệch được biểu thị dưới dạng trung vị với phạm vi giữa các phần tư. Ý nghĩa thống kê được đánh giá bằng ANOVA, tiếp theo là thử nghiệm Newman-Keuls hoặc Dunn; Tất cả các bài kiểm tra đều có hai mặt. Dữ liệu nguồn có sẵn trong tệp Dữ liệu nguồn.

Hình ảnh kích thước đầy đủ
Phân tích giải trình tự RNA đơn bào cho thấy các hồ sơ phiên mã riêng biệt trong các tế bào được xử lý bằng corisin
Phân tích giải trình tự RNA đơn bào đã được thực hiện để đánh giá tác động phiên mã của corisin đối với các tế bào biểu mô ống gần nguyên phát của thận ở người, so sánh các tế bào được điều trị bằng corisin với những tế bào được xử lý bằng đối chứng peptide xáo trộn. Các biểu đồ violin cho thấy mức độ biểu hiện cao hơn đáng kể, trong khi các biểu đồ Xấp xỉ và Chiếu đa tạp đồng nhất (UMAP) xác nhận cường độ biểu hiện cao hơn trên quần thể tế bào đối với các dấu hiệu SASP và liên quan đến lão hóa khác nhau, bao gồm chất ức chế kinase phụ thuộc cyclin 1 A (CDKN1A), thành viên họ serpin E 1 (SERPINE1), phối tử chemokine mô típ CX 8 (CXCL8), protein liên kết yếu tố tăng trưởng giống insulin 5 (IGFBP5), yếu tố tăng trưởng giống EGF liên kết với heparin (HBEGF) và các dấu hiệu EMT như tropomyosin 2 (TPM2) và transgelin (TAGLN) (Hình E). 8A, B). Sự biểu hiện của các dấu hiệu EMT khác, bao gồm chuỗi nhẹ myosin 9 (MYL9) và calponin 1 (CNN1), cũng được điều chỉnh lên đáng kể trong các tế bào được xử lý bằng corisin so với các đối chứng peptide xáo trộn (Hình E). 8C). Ngoài ra, một số dấu hiệu SASP khác đã tăng lên đáng kể khi có sự hiện diện của corisin so với peptide xáo trộn, bao gồm ngừng tăng trưởng và alpha gây tổn thương DNA (GADD45A), gen ung thư u tế bào tủy (MYC), yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi 1 (FGF1), yếu tố hoại tử khối u (TNF), phối tử chemokine motif CC 20 (CCL20), amphiregulin (AREG), tiểu đơn vị inhibin beta A (INHBA), phối tử chemokine motif C-X-C 5 (CXCL5), phối tử chemokine motif C-X-C 3 (CXCL3) và yếu tố tăng trưởng thần kinh (NGF) (Hình E). 8D).

Hình 8: Corisin gây ra sự biểu hiện của các yếu tố liên quan đến lão hóa trong các tế bào biểu mô ống gần thận nguyên phát.
figure 8
A Tế bào biểu mô ống gần thận (RPTEC) được nuôi cấy trong 24 giờ với sự hiện diện của corisin hoặc peptide xáo trộn và sau đó được phân tích giải trình tự RNA đơn bào. B Biểu đồ violin và biểu đồ Xấp xỉ và Chiếu đa tạp đồng nhất (UMAP) mô tả sự biểu hiện của các dấu hiệu lão hóa và các thành phần kiểu hình bài tiết liên quan đến lão hóa (SASP) trong các tế bào được xử lý bằng corisin và peptide xáo trộn. Phân tích thống kê được thực hiện bằng cách sử dụng thử nghiệm Mann-Whitney U hai mặt. C Biểu đồ violin và biểu đồ UMAP minh họa sự biểu hiện của các dấu hiệu chuyển tiếp biểu mô-trung mô (EMT) trong các tế bào được xử lý bằng corisin và peptide xáo trộn. Phân tích thống kê được thực hiện bằng cách sử dụng thử nghiệm Mann-Whitney U hai đuôi. D Các dấu hiệu lão hóa, SASP và EMT bổ sung trong các tế bào được xử lý bằng corisin và peptide xáo trộn. Phân tích thống kê được thực hiện bằng cách sử dụng thử nghiệm Mann-Whitney U hai mặt. Đối với bảng B, C và D, giải trình tự RNA đơn bào được thực hiện bằng cách sử dụng ba chất nuôi cấy RPTEC độc lập trên mỗi chất kích thích, thu được 9327 tế bào chất lượng cao cho nhóm được xử lý corisin và 8186 tế bào cho nhóm peptide (đối chứng) xáo trộn. Biểu đồ violin trong (B–D), đại diện cho sự phân bố của các giá trị biểu hiện gen. Chiều rộng của mỗi violin tương ứng với ước tính mật độ nhân. Thanh dọc dày trong mỗi cây vĩ cầm biểu thị phạm vi giữa các phần tư (phân vị thứ 25-5) và đường mỏng (râu) kéo dài đến các giá trị tối thiểu và tối đa trong vòng 1,5 lần phạm vi giữa các phần tư. Dải phân vị không được hiển thị rõ ràng.

Hình ảnh kích thước đầy đủ
Mối quan hệ giữa lão hóa tế bào và EMT sau khi kích thích corisin được đánh giá bằng cách sử dụng phân tích đơn bào. Cụ thể, mức độ biểu hiện của các dấu hiệu trung mô, bao gồm actin cơ trơn α (ACTA2), CNN1, TAGLN và TPM2, đã được so sánh giữa các tế bào có biểu hiện cao và thấp của dấu hiệu lão hóa p21, sử dụng phân tích bảng dự phòng. Thử nghiệm Chi-square cho thấy không có sự gia tăng đáng kể biểu hiện của dấu hiệu trung mô trong các tế bào có nồng độ p21 cao, cho thấy rằng sự lão hóa không trực tiếp thúc đẩy EMT ở mức đơn tế bào trong quá trình kích thích corisin (Hình bổ sung. 23A–D). Đáng chú ý, CXCL8 (IL-8) và yếu tố biệt hóa tăng trưởng 15 (GDF15), các thành phần chính của kiểu hình bài tiết liên quan đến lão hóa (SASP), đã được điều chỉnh tăng đáng kể trong các tế bào cao p21 (Hình bổ sung. 24A, B). Những phát hiện này ngụ ý rằng lão hóa và EMT không có khả năng xảy ra cùng trong các tế bào được kích thích corisin riêng lẻ. Thay vào đó, EMT có thể là kết quả của các yếu tố SASP tiết ra trong quá trình lão hóa do corisin gây ra chứ không phải là hậu quả trực tiếp của lão hóa tế bào. Tương tự, không có sự gia tăng đáng kể các dấu hiệu proapoptotic p53, BAX và caspase 3 được quan sát thấy ở các tế bào có mức p21 tăng cao, cho thấy rằng sự lão hóa và apoptosis có thể xảy ra trong các quần thể tế bào riêng biệt trong quá trình kích thích corisin (Hình bổ sung. 25A–C).

Một bản đồ nhiệt chứng minh các hồ sơ phiên mã riêng biệt của các gen được điều chỉnh lên và giảm chính trong các tế bào được xử lý bằng corisin so với các đối chứng peptide bị xáo trộn (Hình E). 9A). Phân tích biểu đồ núi lửa làm nổi bật các gen được điều chỉnh lên đáng kể nhất trong các tế bào được xử lý bằng corisin, bao gồm CNN1, CXCL5, IGFBP5, INHBA, protein do p53 gây ra với miền chết 1 (PIDD1) và họ vị trí tích hợp MMTV loại không cánh, thành viên 7 A (WNT7A), với những thay đổi gấp vượt quá 2 và giá trị P dưới 0,05. Ngược lại, các gen như miền cuộn có chứa 160 (CCDC160) và yếu tố giống krüppel 15 (KLF15) nằm trong số những gen được điều chỉnh giảm đáng kể (Hình E). 9B).

Hình 9: Kích thích corisin trong các tế bào biểu mô ống gần thận nguyên phát thúc đẩy các con đường liên quan đến phản ứng tổn thương DNA, lão hóa tế bào, kiểu hình bài tiết liên quan đến lão hóa (SASP) và biệt hóa giống như nguyên bào cơ.
figure 9
Bản đồ nhiệt cho thấy biểu hiện gen trong các tế bào được kích thích bằng corisin hoặc đối chứng peptide xáo trộn. B Biểu đồ núi lửa cho thấy các gen biểu hiện khác nhau giữa tế bào biểu mô ống gần thận (RPTEC) được xử lý bằng corisin và peptide xáo trộn, dựa trên giải trình tự RNA đơn bào. Mỗi điểm đại diện cho một gen, với trục x hiển thị sự thay đổi gấp2 log và trục y hiển thị giá trị p được điều chỉnh -log10. Phân tích biểu hiện vi phân được thực hiện bằng cách sử dụng thử nghiệm Mann-Whitney U hai đuôi. Vì biểu hiện gen được đánh giá trên hàng nghìn gen, giá trị p đã được điều chỉnh để so sánh nhiều lần bằng phương pháp Benjamini-Hochberg để kiểm soát tỷ lệ phát hiện sai. Phân tích làm giàu con đường của C Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) cho thấy sự đại diện quá mức đáng kể của các con đường liên quan đến lão hóa tế bào trong các tế bào biểu mô ống gần thận được điều trị bằng corisin. Phân tích làm giàu được thực hiện bằng cách sử dụng thử nghiệm siêu hình học và giá trị p được điều chỉnh để so sánh nhiều lần bằng phương pháp Benjamini-Hochberg để kiểm soát tỷ lệ phát hiện sai. D Phân loại các gen biểu hiện khác nhau theo vai trò sinh học của chúng, thể hiện sự tham gia của chúng trong các quá trình tế bào khác nhau.

Hình ảnh kích thước đầy đủ
Phân tích làm giàu con đường bằng cách sử dụng các thuật ngữ Bách khoa toàn thư về Gen và Bộ gen (KEGG) của Kyoto cho thấy sự làm giàu đáng kể của các con đường liên quan đến tín hiệu p53, lão hóa tế bào và tín hiệu interleukin-17 (IL-17), trong số những con đường khác. Đáng chú ý, các con đường liên quan đến điều hòa chu kỳ tế bào, tương tác thụ thể cytokine-cytokine và các con đường liên quan đến ung thư cũng được làm nổi bật, cho thấy tác động rộng rãi của corisin đối với các quá trình liên quan đến viêm, lão hóa và tăng sinh tế bào (Hình E). 9C).

Phân loại các gen biểu hiện khác biệt theo vai trò sinh học của chúng cho thấy sự biểu hiện của các dấu hiệu liên quan đến phản ứng tổn thương DNA (cụm màu xanh lam), lão hóa tế bào (cụm màu đỏ), các yếu tố giống nguyên bào sợi cơ (cụm màu xanh lá cây) và kiểu hình bài tiết liên quan đến lão hóa (cụm màu vàng) trong các tế bào được xử lý bằng corisin so với các đối chứng peptide bị xáo trộn (Hình E). 9D).

Những kết quả này cho thấy rằng kích thích corisin trong các tế bào biểu mô ống thận thúc đẩy các con đường liên quan đến phản ứng tổn thương DNA, gây lão hóa tế bào, góp phần vào sự phát triển của kiểu hình bài tiết liên quan đến lão hóa và tăng cường sự biệt hóa giống như nguyên bào cơ. Điều này càng chỉ ra rằng corisin có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy xơ hóa thận bằng cách thúc đẩy cả sự lão hóa tế bào và kiểu hình xơ hóa.

Sự thảo luận
Nghiên cứu này chứng minh rằng sự gia tăng giải phóng corisin của hệ vi sinh vật ở bệnh nhân mắc bệnh thận mạn do tiểu đường và chuột bị xơ hóa thận tương quan với mức độ nghiêm trọng của bệnh và rối loạn chức năng thận, góp phần vào sự tiến triển của xơ hóa thận và tương tác với albumin huyết thanh của người để tạo điều kiện thuận lợi cho việc vận chuyển đến thận, nơi nó đẩy nhanh quá trình lão hóa tế bào và gây ra quá trình chuyển đổi biểu mô-trung mô.

Sự tham gia của rối loạn vi sinh vật trong cơ chế bệnh sinh của xơ hóa thận ở bệnh thận thận ở bệnh thận mạn do tiểu đường đã thu hút sự chú ý ngày càng tăng do tác động đáng kể của nó đối với viêm, rối loạn trao đổi chất và chức năng thận tổng thể. Sự phá vỡ hệ vi sinh vật đường ruột có liên quan đến tình trạng viêm toàn thân tăng cao và thay đổi phản ứng miễn dịch, rất quan trọng trong sự tiến triển của xơ hóa thận66. Loạn khuẩn cũng có liên quan đến sự kích hoạt của hệ thống renin-angiotensin trong thận, góp phần tiếp tục gây tổn thương thận trong bệnh thận tiểu đường67. Ngoài ra, rối loạn vi sinh vật có thể tham gia vào việc sản xuất quá mức và tích tụ các chất chuyển hóa của vi khuẩn, bao gồm độc tố urê liên kết với albumin như indoxyl sulfate, p-cresyl sulfate, phenyl sulfate và 4-ethylphenyl sulfate19,20,21,22. Những chất chuyển hóa này góp phần gây ra stress oxy hóa, quá trình chết rụng tế bào thận, viêm và hoạt động profibrotic, làm trầm trọng thêm tổn thương thận trong bệnh thận tiểu đường68,69. Tuy nhiên, tiềm năng của các chất chuyển hóa có nguồn gốc từ hệ vi sinh vật cụ thể làm dấu ấn sinh học đáng tin cậy cho chứng loạn khuẩn hoặc mục tiêu điều trị vẫn chưa chắc chắn66,70. Nghiên cứu trước đây của chúng tôi cho thấy nồng độ corisin tăng cao, một peptide có nguồn gốc từ hệ vi sinh vật, trong máu của những bệnh nhân mắc các tình trạng nghiêm trọng khác nhau, bao gồm xơ phổi vô căn kèm theo đợt cấp tính, tổn thương phổi cấp tính liên quan đến COVID-19 và viêm đường mật cấp tính27,30,71. Corisin gây ra quá trình chết rụng của các tế bào nhu mô, bao gồm cả tế bào trong phổi và thận, đồng thời thúc đẩy viêm bằng cách kích thích bài tiết các cytokine và chemokine gây viêm và kích hoạt hệ thống đông máu28,29. Tuy nhiên, vai trò của nó trong bệnh thận tiểu đường vẫn chưa rõ ràng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tóm tắt tác dụng apoptotic của corisin trên tế bào thận bằng cách sử dụng tế bào podocytes chính của người và tế bào biểu mô ống thận và chứng minh rằng mAb chống corisin làm giảm đáng kể tổn thương tế bào do corisin gây ra trong ống nghiệm đồng thời giảm thiểu xơ hóa thận và rối loạn chức năng ở chuột mắc bệnh tiểu đường. Hơn nữa, chúng tôi quan sát thấy rằng nồng độ corisin tuần hoàn tăng cao ở bệnh nhân tiểu đường bị CKD và ở chuột bị xơ hóa thận do tiểu đường có liên quan đến rối loạn chức năng thận và tiến triển xơ hóa. Điều thú vị là nồng độ corisin huyết thanh cũng tăng đáng kể ở bệnh nhân không mắc bệnh nhân mắc bệnh thận mạn so với các đối chứng khỏe mạnh, cho thấy rối loạn điều hòa corisin cũng có thể xảy ra ở bệnh thận mạn do nguyên nhân không phải tiểu đường. Những quan sát này nhấn mạnh vai trò của corisin trong sự tiến triển của xơ hóa thận và làm nổi bật tiềm năng của nó như một mục tiêu điều trị trong tình trạng suy nhược này. Tuy nhiên, mức độ tương tác của corisin với các độc tố thận urê khác tích tụ trong bệnh thận do tiểu đường, cũng như mức độ tác dụng bổ sung của chúng, vẫn chưa rõ ràng và cần được nghiên cứu thêm.

Quá trình apoptosis rối loạn điều hòa có liên quan phức tạp đến quá trình lão hóa tế bào. Với sự lão hóa, các tế bào tích lũy tổn thương và stress oxy hóa, làm tăng hoạt động apoptotic góp phần vào thoái hóa mô và xơ hóa, cuối cùng dẫn đến suy giảm chức năng cơ quan57,58. Các tế bào lão hóa tích tụ trong các mô theo thời gian, làm trầm trọng thêm tình trạng xơ hóa bằng cách giải phóng một loạt các yếu tố tiền viêm và tiền xơ hóa, được gọi là Kiểu hình bài tiết liên quan đến lão hóa (SASP)72. Kiểu hình này bao gồm cytokine, yếu tố tăng trưởng và protease, duy trì trạng thái viêm mãn tính, thúc đẩy xơ hóa73 đang diễn ra. Các cơ chế như vậy nhấn mạnh sự lão hóa là một yếu tố then chốt trong cơ chế bệnh sinh của xơ hóa cơ quan, đặc biệt là ở bệnh nhân thận mạn tiểu đường. Một phản ứng thích ứng quan trọng cho phép các tế bào tránh được sự lão hóa là EMT60. Quá trình này liên quan đến sự biến đổi các tế bào biểu mô thành nguyên bào sợi cơ, là trung tâm của quá trình tái tạo mô xơ hóa và là nhà sản xuất nhiều collagen74. Các nguyên bào sợi cơ này có thể bắt nguồn từ các tế bào biểu mô cư trú, nguyên bào sợi hoặc tế bào xơ tuần hoàn, dẫn đến lắng đọng ma trận ngoại bào quá mức và hình thành sẹo75,76. Trong bệnh thận mạn do đái tháo đường, các quá trình xơ hóa này được tăng cường bởi stress oxy hóa do tăng đường huyết gây ra và kích hoạt các con đường tín hiệu TGFβ, tiếp tục thúc đẩy xơ hóa77.

Mặc dù EMT được ghi nhận rõ ràng trong ống nghiệm và đã được quan sát thấy trong một số mô hình in vivo, nhưng tầm quan trọng của nó trong bệnh thận mạn ở người vẫn là một chủ đề gây tranh cãi đáng kể78. Bằng chứng gần đây cho thấy rằng thay vì trải qua quá trình chuyển đổi hoàn toàn thành nguyên bào sợi cơ, các tế bào biểu mô hình ống thận có thể có được các đặc điểm trung mô và khả năng tiết ra các cytokine profibrotic trong khi vẫn gắn vào màng đáy, một hiện tượng được gọi là EMT79,80 một phần. Khái niệm này cung cấp một góc nhìn sắc thái hơn về cách các tế bào biểu mô góp phần vào quá trình xơ hóa thận trong khi vẫn giữ được các khía cạnh của bản sắc biểu mô của chúng. Trong nghiên cứu hiện tại của chúng tôi, chúng tôi quan sát thấy rằng việc tiếp xúc với corisin làm tăng đáng kể các dấu hiệu lão hóa tế bào, bao gồm hoạt động SAβGal và biểu hiện của p16, p21, p27 và p53, đồng thời làm giảm dấu hiệu tăng sinh Ki-67. Nồng độ osteopontin protein SASP tăng lên đáng kể trong tế bào podocytes ở người và tế bào biểu mô ống thận nguyên phát, cho thấy rằng corisin gây ra sự lão hóa trong tế bào thận. Về EMT, corisin thúc đẩy sự biến đổi trung mô trong ống nghiệm ở cả tế bào podocytes và tế bào biểu mô ống thận, có khả năng thông qua việc tiết ra các yếu tố SASP. Những phát hiện này cho thấy rằng sự lão hóa liên quan đến corisin có thể góp phần vào sự mở rộng của các tế bào sản xuất collagen, mặc dù ý nghĩa in vivo của tác dụng thúc đẩy EMT này vẫn chưa được làm rõ. Điều quan trọng là hầu hết các dấu hiệu lão hóa và EMT đã bị suy giảm bằng cách đồng điều trị với kháng thể đơn dòng chống corisin. Ngoài ra, phân tích giải trình tự RNA đơn bào của các tế bào biểu mô hình ống gần thận đã củng cố những quan sát này, chứng minh rằng corisin gây ra sự lão hóa tế bào, góp phần vào sự phát triển của SASP và tăng cường sự biệt hóa giống như nguyên bào cơ. Nói chung, những phát hiện này cho thấy rằng corisin đóng một vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy quá trình xơ hóa thận bằng cách thúc đẩy quá trình lão hóa tế bào và kiểu hình xơ hóa.

Lão hóa tế bào là một quá trình động, không đồng nhất và nhiều giai đoạn được điều chỉnh bởi nhiều yếu tố, bao gồm loại tế bào, mức độ tổn thương, thời gian tiếp xúc với căng thẳng và bản chất của các con đường tín hiệu nội bào được kích hoạt81,82. Mặc dù người ta đã chứng minh rằng các tế bào lão hóa thường điều chỉnh các protein chống apoptotic (ví dụ: các thành viên của họ BCL-2) như một cơ chế sống sót dưới căng thẳng mãn tính, điều này không được quan sát thấy phổ biến trên tất cả các loại tế bào hoặc giai đoạn lão hóa81,83. Ví dụ, có bằng chứng cho thấy nguyên bào sợi lão hóa có khả năng chống lại các kích thích apoptotic so với các đối tác trẻ hơn của chúng, mặc dù biểu hiện mức độ protein BCL-2 thấp84. Ngược lại, các tế bào nội mô mạch máu thể hiện khả năng tăng nhạy cảm với quá trình chết rụng trong quá trình lão hóa85 liên quan đến việc tăng kích hoạt các con đường tín hiệu liên quan đến ROS86 và giảm biểu hiện Bcl-2 cùng với mức độ tăng cao của protein pro-apoptosis Bax87. Trong nghiên cứu của chúng tôi, kích thích bằng corisin gợi ra các dấu hiệu của cả lão hóa và quá trình chết rụng. Cụ thể, tế bào chân ở người và tế bào biểu mô ống thận cho thấy biểu hiện cao của các dấu hiệu lão hóa, bao gồm p21 và SAβGal. Đồng thời, tiếp xúc với corisin trong 24 và 48 giờ dẫn đến giảm rõ rệt nồng độ Bcl-2 và survivin, kèm theo sự gia tăng chết của tế bào apoptotic. Phân tích tế bào dòng chảy hỗ trợ phản ứng kép này, cho thấy cả sự ngừng pha G0 / G1, đặc điểm của sự lão hóa và tỷ lệ tế bào tăng lên ở giai đoạn S và subG1, sau này thường phản ánh sự phân mảnh DNA liên quan đến quá trình apoptosis. Những phát hiện này cho thấy rằng corisin gây ra một kiểu hình căng thẳng lai tham gia vào cả các con đường tín hiệu liên quan đến lão hóa và apoptosis, phản ánh các phản ứng tế bào được mô tả trước đây trong các tế bào nội mô dưới căng thẳng kéo dài. Tùy thuộc vào bản chất và cường độ của sự xúc phạm, các tế bào có thể kích hoạt song song cả hai chương trình, với số phận cuối cùng được xác định bởi sự cân bằng của các tín hiệu ủng hộ sự sống còn và ủng hộ cái chết81. Hơn nữa, phân tích phiên mã đơn bào của chúng tôi cho thấy rằng các tế bào có biểu hiện p21 cao không biểu hiện đồng đều các dấu hiệu pro-apoptotic, cho thấy sự tồn tại của các quần thể phụ riêng biệt, một số trải qua quá trình apoptosis và những người khác bước vào quá trình lão hóa. Quan sát này làm tăng khả năng corisin gây ra đủ căng thẳng để kích hoạt quá trình chết rụng ở một tập hợp con tế bào trong khi mồi cho một tập hợp con tế bào khác để lão hóa. Các nghiên cứu theo thời gian trong tương lai và phân tích đơn bào sâu hơn sẽ rất cần thiết để mô tả động lực học thời gian và các chất điều hòa phân tử chi phối số phận tế bào khác nhau này.

Albumin rất cần thiết cho việc vận chuyển và phân phối các chất khác nhau, bao gồm cả các chất chuyển hóa của vi sinh vật, trong cơ thể con người. Nó liên kết và mang các chất liên kết với protein, đảm bảo chuyển động của chúng giữa các khoang cơ thể khác nhau, điều này rất quan trọng để duy trì cân bằng nội môi sinh lý88,89. Albumin tạo điều kiện thuận lợi cho việc vận chuyển hormone, kim loại và axit béo bằng cách liên kết với các vị trí cụ thể, làm cho nó trở thành một nhân tố quan trọng trong cơ chế điều hòa của cơ thể89. Ngoài ra, nó tham gia vào việc vận chuyển thuốc và các chất độc hại, ảnh hưởng đáng kể đến dược động học và độc tính động học của chúng90. Albumin cũng có thể mang các chất vào tế bào thông qua các thụ thể khác nhau của nó. Trong nghiên cứu hiện tại của chúng tôi, sử dụng các mô phỏng động lực học phân tử và các thí nghiệm xác nhận, chúng tôi phát hiện ra rằng corisin tương tác với albumin của con người, cho thấy albumin huyết thanh là chất mang corisin tiềm năng. Tương tác này cải thiện cấu trúc của corisin và tăng cường hoạt động pro-appoptotic của nó chống lại tế bào chân và tế bào biểu mô ống thận. Hơn nữa, chúng tôi phát hiện phức hợp corisin-albumin trong nước tiểu của bệnh nhân tiểu đường mắc bệnh thận mạn mạch, hỗ trợ vai trò của albumin trong việc vận chuyển corisin đến các khoang trong ống của thận trong điều kiện tiểu đường. Albuminuria là một dấu hiệu được công nhận rõ ràng về sự tiến triển của CKD, đặc biệt là ở những bệnh nhân mắc bệnh thận tiểu đường92,93,94. Một khi albumin niệu phát triển, chức năng thận suy giảm nhanh hơn92,93,94. Mặc dù cơ chế cơ bản vẫn chưa rõ ràng, nhưng bằng chứng cho thấy albuminuria gây ra tác dụng gây độc tế bào trên các tế bào biểu mô ống và tế bào chân, dẫn đến quá trình chết rụng, viêm, xơ hóa và tổn thương thận sau đó, cuối cùng làm trầm trọng thêm rối loạn chức năng thận51,52,53. Phát hiện của chúng tôi cho thấy corisin, khi liên kết với albumin, có thể góp phần vào tác dụng độc hại liên quan đến albumin niệu ở bệnh nhân tiểu đường mắc bệnh thận mạn. Các thụ thể albumin có thể tạo điều kiện thuận lợi cho sự xâm nhập của corisin liên kết với albumin vào tế bào chân và tế bào biểu mô ống thận gần, làm trầm trọng thêm tổn thương tế bào (Hình E). 10). Cụ thể, chúng tôi đã xác định cubilin, một thụ thể albumin được biểu hiện cao trong tế bào thận và rất quan trọng đối với việc tái hấp thu albumin trong các tế bào biểu mô hình ống, là chất trung gian của sự xâm nhập corisin vào tế bào thận95,96,97. Điều này cho thấy cubilin có thể là một yếu tố quan trọng gây tổn thương tế bào trong bệnh thận tiểu đường. Nhìn chung, kết quả của chúng tôi chỉ ra rằng albumin và cubilin thụ thể của nó đóng vai trò quan trọng trong việc tạo điều kiện cho corisin xâm nhập vào tế bào thận và thúc đẩy tổn thương nội bào, do đó đẩy nhanh tổn thương thận và xơ hóa trong bệnh thận tiểu đường. Nghiên cứu sâu hơn về tương tác giữa albumin, cubilin và corisin có thể cung cấp các phương tiện điều trị mới để ngăn ngừa hoặc làm chậm sự tiến triển của bệnh thận ở bệnh nhân tiểu đường.

Hình 10: Tổn thương tế bào thận và xơ hóa do Corisin gây ra trong bệnh thận mãn tính do tiểu đường và tiềm năng bảo vệ của kháng thể đơn dòng kháng corisin.
figure 10
Rối loạn khuẩn liên quan đến bệnh tiểu đường làm tăng giải phóng corisin từ hệ vi sinh vật vào tuần hoàn toàn thân, nơi nó liên kết với albumin huyết thanh. Phức hợp corisin-albumin đến các tế bào biểu mô cầu thận và ống gần, liên kết với cubilin, một thụ thể albumin, và do đó tạo điều kiện cho corisin xâm nhập vào tế bào chân và tế bào biểu mô ống gần. Trong các tế bào này, corisin gây ra kiểu hình bài tiết liên quan đến lão hóa, dẫn đến tăng tiết các cytokine viêm, chemokin, metalloproteinase ma trận và các yếu tố tăng trưởng thúc đẩy viêm, chuyển đổi biểu mô-trung mô, quá trình chết rụng của tế bào chân và tế bào biểu mô hình ống, tuyển dụng nguyên bào sợi và lắng đọng ma trận ngoại bào (ví dụ: collagen I). Các khu vực của cầu thận và ống bị ảnh hưởng bởi quá trình apoptosis tăng sau đó được thay thế bằng mô xơ hóa, đẩy nhanh sự tiến triển của bệnh và cuối cùng dẫn đến kết quả tử vong. Kháng thể đơn dòng chống corisin liên kết với peptide corisin, ngăn chặn hoạt động tiền lão hóa của chúng và giảm thiểu sự tiến triển của bệnh. mAb, kháng thể đơn dòng.

Hình ảnh kích thước đầy đủ
Khi tế bào xâm nhập, chế độ hoạt động phân tử nội bào chính xác của corisin vẫn chưa được hiểu đầy đủ. Tuy nhiên, các nghiên cứu trước đây của chúng tôi đã chứng minh rằng corisin gây ra quá trình apoptosis thông qua rối loạn chức năng ty thể và kích hoạt con đường apoptosis nội tại. Cụ thể, điều trị corisin dẫn đến tăng tích tụ các loại oxy phản ứng (ROS), khử cực màng ty thể và kích hoạt các yếu tố proapoptotic. Hơn nữa, nghiên cứu trước đó của chúng tôi tiết lộ rằng corisin thúc đẩy phosphoryl hóa p53, một chất điều chỉnh quan trọng chi phối cả quá trình apoptosis và lão hóa. Dựa trên những phát hiện này, nghiên cứu hiện tại thiết lập rằng corisin đẩy nhanh quá trình lão hóa tế bào. Cho rằng rối loạn chức năng ty thể và căng thẳng oxy hóa là những động lực được công nhận rõ ràng của sự lão hóa tế bào và p53 đóng vai trò điều hòa kép trong quá trình apoptosis và lão hóa thông qua điều chế p21, những phát hiện hiện tại của chúng tôi, cho thấy sự biểu hiện cao của các dấu hiệu liên quan đến lão hóa, bao gồm p21 và p53, cho thấy mạnh mẽ rằng căng thẳng tế bào do corisin gây ra và rối loạn chức năng ty thể góp phần vào các con đường liên quan đến lão hóa. Tuy nhiên, các nghiên cứu sâu hơn là cần thiết để xác định một cách thuyết phục liệu rối loạn chức năng ty thể qua trung gian corisin và stress oxy hóa có chủ động thúc đẩy sự lão hóa và ảnh hưởng đến kết quả tế bào lâu dài hay không.

Nghiên cứu hiện tại có một số hạn chế. Đầu tiên, thành phần lâm sàng dựa trên một nhóm bệnh nhân tương đối nhỏ từ một trung tâm duy nhất, điều này có thể hạn chế khả năng khái quát hóa các phát hiện. Thứ hai, sự đóng góp cụ thể hoặc phụ gia của corisin không thể được phân biệt rõ ràng với các chất hòa tan và độc tố giữ urê khác được biết là góp phần vào các quá trình tạo sợi. Thứ ba, chúng tôi không điều tra sự tham gia tiềm ẩn của vi khuẩn sản xuất corisin tại các vị trí niêm mạc khác, chẳng hạn như phổi hoặc da, cũng có thể ảnh hưởng đến nồng độ corisin toàn thân. Cuối cùng, sự hiểu biết cơ học về các con đường tín hiệu hạ lưu mà qua đó corisin thúc đẩy xơ hóa vẫn chưa đầy đủ. Tuy nhiên, những phát hiện được trình bày trong nghiên cứu này cung cấp nền tảng vững chắc cho các cuộc điều tra trong tương lai để xác định vai trò chính xác của corisin trong xơ hóa thận và đánh giá tiềm năng của nó như một mục tiêu điều trị mới.

Tóm lại, nghiên cứu này nhấn mạnh vai trò quan trọng của corisin trong sự tiến triển của xơ hóa thận liên quan đến bệnh tiểu đường. Phát hiện của chúng tôi chứng minh rằng corisin được điều chỉnh tăng đáng kể ở bệnh nhân mắc bệnh thận mạn do tiểu đường và trong các mô hình động vật của xơ hóa thận, tương quan chặt chẽ với mức độ nghiêm trọng của bệnh và rối loạn chức năng thận. Corisin tăng cường xơ hóa thận thông qua tương tác với albumin huyết thanh của con người, tạo điều kiện thuận lợi cho việc vận chuyển đến thận. Tương tác này thúc đẩy quá trình lão hóa tế bào và gây ra EMT, cơ chế trung tâm của sự tiến triển của xơ hóa thận. Quan trọng hơn, can thiệp điều trị của chúng tôi bằng cách sử dụng kháng thể đơn dòng chống corisin đã cải thiện đáng kể chức năng thận và ngăn chặn xơ hóa ở chuột mắc bệnh tiểu đường, nhấn mạnh tiềm năng của corisin như một mục tiêu điều trị mới (Hình E). 10). Những hiểu biết mới này có thể dẫn đến các phương pháp điều trị sáng tạo giúp giảm thiểu suy giảm thận và cải thiện kết quả của bệnh nhân trong bệnh thận tiểu đường, một gánh nặng sức khỏe đáng kể trên toàn thế giới.

Phương pháp
Bệnh nhân
Nghiên cứu cắt ngang này bao gồm 35 bệnh nhân mắc bệnh thận mãn tính do tiểu đường (CKD) đã đến các cơ sở của chúng tôi từ tháng Sáu đến tháng 12 năm 2023. Tiêu chí đưa vào bao gồm chẩn đoán DM và CKD. Bệnh nhân đang điều trị chống ung thư và những người có dữ liệu không đầy đủ hoặc không đủ chất lượng mẫu đã bị loại khỏi nghiên cứu (Hình E). 1A). Bảng bổ sung 1 tóm tắt nhân khẩu học, đặc điểm lâm sàng, tình trạng y tế tiềm ẩn, phương pháp điều trị và dữ liệu phòng thí nghiệm thông thường của bệnh nhân. Việc chẩn đoán và điều trị DM tuân theo các tiêu chí được khuyến nghị bởi Hiệp hội Đái tháo đường Hoa Kỳ (ADA)98. Chẩn đoán và phân loại CKD tuân thủ hướng dẫn Bệnh thận: Cải thiện kết quả toàn cầu (KDIGO)99.100. Các mẫu máu và nước tiểu được lấy từ tất cả các bệnh nhân và ly tâm, và huyết thanh và phần nổi trên nước tiểu được thu thập và bảo quản ở -80 °C cho đến khi phân tích. Năm bệnh nhân (2 nam và 3 nữ; tuổi trung bình ± SD: 51,4 ± 9,4 tuổi) mắc bệnh thận mãn tính không do tiểu đường (CKD) cũng được đưa vào kiểm soát bệnh. Nguyên nhân cơ bản của CKD là tăng huyết áp động mạch (3 trường hợp), tăng axit uric máu kèm theo béo phì (1 trường hợp) và hội chứng urê huyết tán huyết (1 trường hợp). Trong số những bệnh nhân này, bốn người được phân loại là giai đoạn G3 và một người là giai đoạn G5, với eGFR trung bình là 37,1 ± 18,5 mL / phút / 1,73 m². Ngoài ra, mẫu huyết thanh từ 20 tình nguyện viên khỏe mạnh và mẫu nước tiểu từ 5 tình nguyện viên khỏe mạnh được đưa vào như đối chứng khỏe mạnh.

Sinh mổ thận người
Các bộ phận thận ở người, nhúng parafin cố định formalin được lấy từ OriGene, bao gồm các mẫu từ bệnh nhân mắc bệnh thận mãn tính và những người có mô học bình thường. Các phần này được sử dụng để nhuộm miễn dịch p21, corisin và đánh giá sự phân mảnh DNA.

Động vật
Chuột đực loại hoang dã (WT) C57BL / 6 J (Nihon SLC, Hamamatsu, Nhật Bản) và chuột chuyển gen TGFβ1 (TG) có nền C57BL / 6 J, tự nhiên phát triển xơ hóa thận tiến triển và gây tử vong, đã được sử dụng trong thí nghiệm31. Những con chuột, 8–9 tuần tuổi, nặng từ 20 đến 26 g. Mô hình chuột chuyển gen TGFβ1 (TG), trên nền C57BL / 6 J, được thiết kế đặc biệt để biểu hiện quá mức gen TGFβ1 ở người có chiều dài đầy đủ trong tế bào chân cầu thận dưới sự kiểm soát của chất xúc tiến podocin chuột31. Chuột TG được tạo ra bằng cách chuẩn bị cấu trúc chuyển gen nhiễm sắc thể nhân tạo (BAC) vi khuẩn podocin-TGFβ1 khảm, có chứa các exon mã hóa có chiều dài đầy đủ và các intron can thiệp của gen TGFβ1 của con người, thay thế locus gen podocin của chuột thông qua tái tổ hợp qua trung gian BAC và kỹ thuật di truyền31. Dòng chuột chuyển gen được thiết lập bằng cách tiêm cấu trúc khảm vào phôi chuột C57BL / 6 J, và những người sáng lập chuyển gen đã được xác minh bằng phân tích Southern blot31. Tất cả các động vật thí nghiệm được lai tạo và nuôi trong một môi trường không có mầm bệnh cụ thể, được duy trì ở nhiệt độ 21 °C với chu kỳ sáng/tối 12 giờ, trong cơ sở động vật thí nghiệm của Đại học Mie. Mỗi lồng chuột được trang bị vật liệu làm tổ bằng len gỗ, và động vật được tiếp cận miễn phí với nước và thức ăn. Phân loại gen của chuột TG được thực hiện bằng cách sử dụng phân tích PCR tiêu chuẩn với DNA được chiết xuất từ các mẫu đuôi và các cặp mồi cụ thể31.

Tuyên bố đạo đức
Tất cả các đối tượng tham gia điều tra lâm sàng đều cung cấp sự đồng ý bằng văn bản và phác đồ nghiên cứu đã được phê duyệt bởi Ủy ban Đạo đức Điều tra Lâm sàng của Đại học Mie (số phê duyệt: H2021-029, ngày phê duyệt: 2021/02/09) và được tiến hành theo các Nguyên tắc của Tuyên bố của Helsinki. Có được sự đồng ý bằng văn bản từ tất cả những người tham gia. Nghiên cứu này tuân thủ các tiêu chuẩn đạo đức, với những nỗ lực để đảm bảo một thiết kế hòa nhập giữa giới tính và tuổi tác, đóng góp công bằng trên các nền tảng địa lý và phân tích dữ liệu xem xét các yếu tố sinh học và xã hội có liên quan. Ủy ban An toàn Thí nghiệm DNA tái tổ hợp (số phê duyệt: I-744, ngày phê duyệt: 2022/11/26; số phê duyệt: I-629, ngày phê duyệt: 2023/08/09) và Ủy ban Điều tra Động vật của Đại học Mie đã phê duyệt các phác đồ thử nghiệm (phê duyệt số: 2023-17, ngày phê duyệt: 2024/01/09; phê duyệt số: 30-14, ngày phê duyệt: 2023/09/04; phê duyệt số: 29-23-sai3-h1, ngày phê duyệt: 2023/09/04). Chúng tôi đã thực hiện tất cả các quy trình thử nghiệm theo các nguyên tắc chăm sóc động vật trong phòng thí nghiệm được quốc tế phê duyệt do Viện Y tế Quốc gia (https://olaw.nih.gov/) công bố. Nghiên cứu tuân theo Hướng dẫn ARRIVE để điều tra trên động vật và các biến số được đo lường một cách mù quáng của các nhóm điều trị.

Thuốc thử
Dòng tế bào ung thư biểu mô thận tế bào trong (Caki-2), có nguồn gốc từ biểu mô của ống gần và tế bào chân nguyên phát ở người được lấy từ Bộ sưu tập nuôi cấy kiểu Mỹ (Manassas, VA), trong khi tế bào biểu mô ống sơ sinh thận ở người (RPTEC) có nguồn gốc từ LONZA (Houston, TX). Môi trường RPMI 1640 (RPMI) được lấy từ Nacalai Tesque (Kyoto, Nhật Bản), trong khi huyết thanh bò thai nhi (FBS) được lấy từ Bio Whittaker (Walkersville, MD). L-glutamine, penicillin và streptomycin được mua từ Invitrogen (Carlsbad, CA). Corisin tổng hợp và peptide xáo trộn tương ứng của nó được tổng hợp và cung cấp bởi Peptide Institute Inc. (Osaka, Nhật Bản) và Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). Các siRNA chống lại mỗi thụ thể albumin được mua từ Origene (Rockville, MD, Hoa Kỳ). Corisin được dán nhãn fluorescein isothiocyanate (FITC) và peptide xáo trộn được dán nhãn FITC cũng đến từ Peptide Institute Inc. (Osaka, Nhật Bản) và MitoTracker™ Red CMXRos là của Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA).

Đánh giá tương tác corisin với albumin tái tổ hợp của người
Hỗn hợp 20 μg albumin người tái tổ hợp với một số lượng corisin tổng hợp hoặc peptide tổng hợp được điều chế trong nước muối và ủ ở 37 °C. Hỗn hợp được trộn kỹ bằng cách pipet, ly tâm và ủ ở 94 °C trong 5 phút. Sau đó, các mẫu được nạp vào gel điện di gel SDS-polyacrylamide 10-20% (SDS-PAGE). Sau đó, Western blotting được thực hiện bằng cách sử dụng kháng corisin mAb 21 A hoặc kháng thể chống albumin.

Đánh giá sự tương tác giữa corisin và albumin huyết thanh của người
Các mẫu huyết thanh từ bệnh nhân mắc bệnh thận tiểu đường và các đối chứng khỏe mạnh được pha loãng theo tỷ lệ 1:20 và ủ trong 10 phút với corisin (4 μg) pha loãng trong nước muối. Đối chứng, một hỗn hợp có chứa corisin (4 μg) và albumin tái tổ hợp của người (rhAlb, 5 μg) cũng đã được điều chế. Mỗi hỗn hợp sau đó được điện di, sau đó là phân tích Western blot bằng cách sử dụng các kháng thể đơn dòng đặc hiệu với corisin hoặc albumin.

Đánh giá tương tác phụ thuộc vào độ pH giữa corisin và albumin huyết thanh của người
Các mẫu huyết thanh từ bệnh nhân mắc bệnh thận tiểu đường và các đối chứng khỏe mạnh được pha loãng 1:20 và ủ trong 10 phút có hoặc không có 10 μg corisin trong dung dịch nước muối được điều chỉnh theo các mức pH khác nhau bằng cách sử dụng axit clohydric. Trong một thí nghiệm riêng biệt, 2,5 μg albumin người tái tổ hợp (rhAlb) được ủ với 3 μg corisin trong nước muối trong các điều kiện pH khác nhau. Mỗi hỗn hợp sau đó được điện di và phân tích bằng Western blotting bằng cách sử dụng các kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho corisin hoặc albumin người.

Cắt bỏ dải gel để phân tích khối phổ
Hỗn hợp corisin và rhAlb trong dung dịch muối và mẫu đối chứng chỉ chứa rhAlb đã được chuẩn bị. Các hỗn hợp được trộn kỹ bằng cách pipet, ly tâm và ủ ở 94 °C trong 5 phút. Sau đó, các mẫu được sử dụng 10–20% SDS-PAGE. Sau khi hoàn thành điện di, gel được lấy ra cẩn thận, rửa nhanh bằng nước cất, sau đó ngâm trong dung dịch cố định có khuấy trong 30 phút. Sau khi cố định, gel được chuyển sang dung dịch nhuộm màu xanh Coomassie và khuấy trong khoảng 2 giờ để hình dung các dải protein. Gel sau đó được nhuộm và hình ảnh đã được chụp. Các dải quan tâm được cắt bỏ khỏi gel bằng dao mổ vô trùng để phân tích khối phổ tiếp theo.

Khối phổ để xác định đồng định vị của corisin với albumin tái tổ hợp của người
Các phân tích proteomic được thực hiện tại Cơ sở Cốt lõi Proteomics của Trung tâm Công nghệ Sinh học Roy J. Carver tại Đại học Illinois Urbana-Champaign. Các dải gel cắt bỏ được cắt thành khối vuông 1 mm và khử nhuộm ba lần với 50% acetonitrile trong 50 mM triethylammonium bicarbonate. Các mảnh gel sau đó được khử nước bằng acetonitrile và phồng lên với 150 μL triethylammonium bicarbonate 50 mM chứa 1 μg trypsin cấp khối phổ (Pierce). Các mẫu được tiêu hóa qua đêm ở 37 °C, và vào ngày hôm sau, các peptide đã tiêu hóa được chiết xuất ba lần với 50% acetonitrile trong axit formic 5%. Các mẫu được sấy khô trong máy hút bụi tốc độ, khử muối bằng StageTips,1, và sau đó sấy khô một lần nữa.

Các peptide được treo lại trong 15 μL acetonitrile 5% trong axit formic 0,1% và 1 μL mỗi mẫu được bơm vào hệ thống UltiMate 3000 RSLCnano kết hợp với máy đo khối phổ Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Quá trình tách peptide được thực hiện bằng cách sử dụng cột Acclaim PepMap 100 C18 25 cm (Thermo Fisher Scientific) được duy trì ở 50 °C, với các pha di động bao gồm 0,1% axit formic trong nước (A) và 0,1% axit formic trong acetonitrile (B). Quá trình rửa giải gradient được thực hiện trong 45 phút từ 2% đến 36% B với tốc độ dòng chảy 300 nL / phút, sau đó rửa cột và cân bằng. Máy đo khối phổ hoạt động ở chế độ ion dương. Các bản quét MS1 (phân tích khối lượng giai đoạn đầu) được thu thập trong phạm vi 300–2000 m / z ở độ phân giải 120.000. Các ion dồi dào nhất được phát hiện trong quét MS1 đã bị phân mảnh CID (phân ly do va chạm) với năng lượng va chạm chuẩn hóa là 35% và quét MS2 (phân tích khối lượng giai đoạn hai) được thu thập trong bẫy ion, với tổng thời gian chu kỳ là 3 giây. Cửa sổ cách ly được đặt ở 1,6 m/z và loại trừ động được áp dụng với thời gian 60 giây.

Dữ liệu LC-MS thô được phân tích bằng cách sử dụng Mascot Distiller v.2.8.4.0 và máy chủ Mascot v.2.8.2 (Matrix Science). Tìm kiếm cơ sở dữ liệu đã được thực hiện dựa trên proteome tham chiếu Homo sapiens từ UniProt (104.451 mục nhập) và một tệp FASTA tùy chỉnh chứa trình tự corisin và peptide xáo trộn. Các thông số tìm kiếm bao gồm dung nạp khối lượng peptide là 10 ppm, dung nạp khối lượng mảnh là 0,6 Da và cho phép tối đa hai lần phân tách tryptic bị bỏ lỡ. Nhận dạng protein được lọc trong Mascot bằng cách sử dụng ngưỡng ý nghĩa mặc định là p < 0,05.

Đồng kết tủa miễn dịch của corisin với albumin người
Một chế phẩm có chứa 5 μg albumin người tái tổ hợp và 50 ng corisin được tạo thành trong 20 μL nước muối đệm Tris (TBS) và sau đó ủ ở 37 ° C trong 30 phút. Sau đó, 2 μg kháng thể đơn dòng chống corisin (mAb) ở nồng độ 1 mg / mL được đưa vào dung dịch và ủ ở 4 ° C trong thêm 30 phút. Các hạt agarose protein G (10 μL) được thêm vào và hỗn hợp được ủ thêm trong 30 phút ở 4 ° C. Sau khi ủ, các hạt được rửa tỉ mỉ ba lần bằng TBS để loại bỏ bất kỳ tương tác không đặc hiệu nào. Sau đó, 10 μL dung dịch đệm nạp 2x natri dodecyl sulfat (SDS) được thêm vào hạt để rửa giải protein, sau đó ly tâm để tách phần nổi trên. Phần nổi của protein đã rửa giải sau đó được áp dụng cho SDS-PAGE 10-20%. Sau điện di, nhuộm màu xanh Coomassie được sử dụng để phân tích các phức hợp protein là kết quả của quy trình đồng kết tủa miễn dịch.

Nuôi cấy tế bào
Tất cả các tế bào được nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640, được làm giàu với 10% huyết thanh bê thai nhi, 0,03% (w / v) L-glutamine, 100 IU / ml penicillin và 100 μg / ml streptomycin. Các môi trường nuôi cấy được duy trì trong môi trường được kiểm soát có khí quyển 5% CO2 ở nhiệt độ không đổi 37 °C.

Kích thích tế bào bằng corisin
Với sự tương tác của corisin với albumin và sự ổn định của nó khi có albumin, trừ khi có quy định khác, tất cả các xét nghiệm tế bào in vitro được thực hiện bằng cách sử dụng corisin pha loãng trong dung dịch có chứa albumin tái tổ hợp của người, trừ khi có quy định khác. Trong khi nồng độ albumin huyết thanh trong huyết tương của người thường là 35-50 g / L (~ 3,5–5% w / v), chúng tôi đã sử dụng 0,5% HSA làm nồng độ liên kết thấp có liên quan về mặt sinh lý để ước tính nồng độ albumin trong vi môi trường ống thận, đặc biệt là trong các tình trạng bệnh lý như bệnh thận tiểu đường, nơi protein niệu dẫn đến rò rỉ albumin vào lòng ống thận. Trong thiết lập thí nghiệm của chúng tôi, phía đỉnh của các tế bào biểu mô hình ống đối mặt với môi trường, mô phỏng tiếp xúc với ống (tiết niệu), nơi corisin có thể có ở trạng thái protein niệu.

Xét nghiệm apoptosis
Để đánh giá quá trình chết rụng, các tế bào (4 × 105 tế bào/giếng) được nuôi cấy trong các đĩa 12 giếng cho đến khi chúng đạt đến độ hợp lưu. Sau đó, chúng bị đói huyết thanh trong 12 giờ và sau đó tiếp xúc với chất kích thích trong 48 giờ. Quá trình chết rụng được định lượng bằng phép đo tế bào dòng chảy (FACScan, BD Biosciences, Oxford, Vương quốc Anh) sử dụng annexin V được dán nhãn huỳnh quang và propidium iodide (Bộ phát hiện apoptosis FITC Annexin V với PI, Biolegend, San Diego, CA). Chiến lược kiểm soát được thể hiện trong Hình bổ sung. 26. Quá trình chết rụng cũng được đánh giá bằng cách sử dụng xét nghiệm dán nhãn đầu cuối deoxynucleotidyl transferase dUTP (TUNEL), được thực hiện tại Tập đoàn MorphoTechnology ở Sapporo, Hokkaido, Nhật Bản, theo các quy trình tiêu chuẩn.

Phân tích tế bào dòng chảy của chu kỳ tế bào
Các tế bào được thu hoạch bằng cách sử dụng trypsin / EDTA và rửa một lần bằng nước muối đệm phốt phát (PBS). Sau khi ly tâm, viên tế bào được xoáy kỹ lưỡng. Để cố định các tế bào, etanol lạnh 70% được thêm từng giọt vào viên trong khi xoáy để tránh vón cục. Các tế bào sau đó được ủ trong etanol ở 4 ° C trong 60 phút. Sau khi cố định, các tế bào được rửa hai lần bằng PBS bằng cách ly tâm ở 850 × g, và phần nổi trên được loại bỏ. Viên thu được được lơ lửng lại và các tế bào được xử lý bằng ribonuclease bằng cách thêm 50 μl RNase A (từ dung dịch gốc 100 μg / ml). Sau đó, 200 μl propidium iodide (PI) được thêm vào từ dung dịch gốc 50 μg / ml để nhuộm DNA. Để phân tích tế bào dòng chảy, tán xạ chuyển tiếp (FSC) và tán xạ bên (SSC) được đo để xác định quần thể tế bào đơn. Để loại trừ các tế bào kép, quá trình xử lý xung được thực hiện bằng cách phân tích PI-Area so với PI-Width.

Xét nghiệm tăng sinh tế bào
Các tế bào được gieo hạt với mật độ 1 × 10⁴ tế bào trên mỗi giếng trong 100 μL môi trường nuôi cấy trong đĩa 96 giếng. Sau đó, các tế bào được kích thích bằng 0, 20 hoặc 40 μg/mL corisin, có hoặc không bổ sung 200 μg/mL mAb chống corisin (21 A) và ủ trong 24 giờ ở 37 °C trong môi trường ẩm có chứa 5% CO₂. Sau khi kích thích, 20 μL Thuốc thử CellTiter 96® AQueous One Solution (Promega Corporation, Madison, MI, USA) được thêm vào mỗi giếng và đĩa được ủ thêm 2 giờ ở 37 °C. Sự tăng sinh tế bào được đánh giá bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 490 nm bằng đầu đọc đĩa 96 giếng.

Đánh giá hình thái hạt nhân
Tế bào podocyte nguyên phát của người và tế bào biểu mô hình ống thận bình thường của người nguyên phát được nuôi cấy trong 48 giờ với sự hiện diện của corisin ở nồng độ 20 μg / mL và 40 μg / mL hoặc nồng độ tương đương của peptide xáo trộn làm đối chứng. Sau khi ủ, các tế bào được cố định và nhuộm bằng 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) để hình thành hình thái hạt nhân. Các thông số hạt nhân, bao gồm diện tích hạt nhân, chu vi và độ tròn, được đánh giá định lượng bằng cách sử dụng ImageJ, một phần mềm phân tích hình ảnh mã nguồn mở. Phân đoạn hình ảnh tự động và ngưỡng được áp dụng để đảm bảo phép đo nhất quán các đặc điểm hạt nhân.

Đánh giá corisin nhắm mục tiêu ty thể trong tế bào thận người
Các dòng tế bào Caki-2 dạng ống thận ở người và tế bào podocytes chính của người được nuôi cấy trong môi trường RPMI-1640 được bổ sung 10% huyết thanh bò thai nhi (FBS) với mật độ gieo hạt 1 × 104 tế bào mỗi giếng. Các tế bào được nuôi cấy trên các slide nuôi cấy 4 giếng phủ collagen I (Corning 354557, Biocoat) và ủ ở 37 °C trong môi trường ẩm với 5% CO2 qua đêm. Ngày hôm sau, môi trường nuôi cấy được thay thế bằng RPMI-1640 có chứa 1% FBS, và tiếp tục ủ ở 37 °C qua đêm. Sau đó, môi trường được thay thế bằng dung dịch có chứa 20 μg / mL corisin được dán nhãn fluorescein isothiocyanate (FITC) trong 0,5% rhAlb hoặc liều lượng tương đương của peptide xáo trộn được dán nhãn FITC, và các tế bào được ủ trong 4 giờ ở 37 ° C. Sau khi ủ, môi trường được hút và các tế bào được rửa ba lần bằng nước muối đệm phốt phát (PBS) không có canxi và magiê để loại bỏ thuốc nhuộm hoặc peptide còn sót lại. Sau đó, các tế bào được xử lý bằng dung dịch nhuộm MitoTracker 20 nM để dán nhãn ty thể trong 30 phút ở 37 °C, sau đó cố định trong 4% paraformaldehyde trong PBS (không có canxi và magiê) trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, và sau đó rửa ba lần bằng PBS. Các nhân được nhuộm bằng 1 μg / mL DAPI (4′, 6-diamidino-2-phenylindole) trong PBS trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó là rửa PBS bổ sung. Hình ảnh được thực hiện bằng kính hiển vi huỳnh quang (Tập đoàn Olympus, Tokyo, Nhật Bản), và hình ảnh được chụp và phân tích bằng phần mềm xử lý hình ảnh.

Đánh giá sự xâm nhập của corisin vào tế bào ống thận trong trường hợp không có albumin
RPTEC được gieo hạt với mật độ 2 × 10⁴ tế bào mỗi giếng trong đĩa nuôi cấy 24 giếng và để bám dính. Môi trường nuôi cấy sau đó được thay thế bằng RPMI, không có albumin hoặc bổ sung 0,5% rhAlb. Corisin được dán nhãn FITC được thêm vào ở nồng độ cuối cùng là 40 μg / mL trong nước muối hoặc 0,5% rhAlb, và các tế bào được ủ trong 4 giờ ở 37 ° C. Sau khi ủ, môi trường được lấy ra và các tế bào được nhuộm bằng 50 nM Mitotracker Red CMXRos, được chuẩn bị từ dung dịch gốc 1 mM trong DMSO, sau đó ủ 30 phút ở 37 °C. Sau đó, các tế bào được rửa sạch bằng PBS (-Ca, -Mg) và cố định bằng 4% paraformaldehyde (PFA) trong PBS (-Ca, -Mg) trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau khi cố định, các tế bào được rửa hai lần bằng PBS (-Ca, -Mg)) và nhuộm bằng 1 μg / mL DAPI trong PBS (-Ca, -Mg) để hình dung nhân, sau đó là hai lần rửa PBS bổ sung. Cuối cùng, phân tích kính hiển vi huỳnh quang được thực hiện để đánh giá sự thâm nhập corisin và khu trú ty thể.

Thấm phương Tây
Các tế bào được rửa hai lần bằng nước muối đệm phốt phát lạnh và sau đó ly giải trong dung dịch đệm RIPA. Dung dịch đệm này bao gồm 10 mM Tris-Cl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0,1% natri deoxycholate, 0,1% SDS, 140 mM NaCl và 1 mM phenylmethylsulfonyl florua. Các chất ức chế protease/phosphatase, bao gồm 1 mM orthovanadate, 50 mM β-glycerophosphate, 10 mM natri pyrophosphate, 5 μg/mL leupeptin, 2 μg/mL aprotinin và 5 mM natri florua, cũng được thêm vào dung dịch đệm. Hỗn hợp thu được được ly tâm ở 17.000 x g trong 10 phút ở 4 ° C và nồng độ protein được xác định bằng bộ xét nghiệm protein Pierce BCA từ Thermo Fisher Scientific Incorporation (Waltham, MA). Các mẫu có lượng protein bằng nhau được trộn với dung dịch đệm mẫu Laemmli và sau đó được tách bằng SDS-PAGE. Đối với Western blotting, màng nitrocellulose và mAb chống corisin đã được sử dụng. Cường độ của các dải trên các vết được định lượng bằng chương trình NIH ImageJ1.54 m do Wayne Rasband phát triển tại Chi nhánh Dịch vụ Nghiên cứu NIH (wayne@codon.nih.gov).

Mô phỏng động lực học phân tử của tập hợp cấu hình của corisin
Thiết lập mô phỏng động lực học phân tử (MDS)
Hai hệ thống mô phỏng riêng biệt đã được xây dựng để quan sát tập hợp cấu trúc của peptide: cấu trúc mở / mở rộng của peptide, được xây dựng trong PyMol 2.1 (https://pymol.org/2/), và cấu trúc gấp của peptide, được xây dựng bởi SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/). Đầu cuối N của peptide được giới hạn bằng cách sử dụng nhóm acetyl trung tính (ACE) và đầu cuối C được đóng bằng cách sử dụng nhóm methylamine trung tính (NME). Peptit được hòa tan trong hộp nước TIP3P trực giao và các hệ thống được trung hòa bởi 150 mM NaCl bằng cách sử dụng Packmol v18.169101.

Tất cả các MDS được thực hiện bằng gói phần mềm Amber18 sử dụng trường lực Amber ff14SB. Mỗi hệ thống MDS đầu tiên được giảm thiểu trong 50000 chu kỳ. Phương pháp thu nhỏ chuyển từ độ dốc nhất trong 5000 chu kỳ đầu tiên sang gradient liên hợp cho 45000 chu kỳ còn lại. Các hệ thống được làm nóng từ 0 K đến 300 K dưới quần thể NVT. Bước làm nóng được tiến hành trong 3 ns bằng cách sử dụng bộ điều nhiệt Langevin với tần số va chạm 2 ps-1. Các hệ thống được cân bằng trong một quần thể NPT trong 2 ns với áp suất 1 bar bằng cách sử dụng khí áp Monte Carlo. Các hệ thống được cân bằng thêm trong một quần thể NPT (300 K và 1 bar) trong 50 ns và trải qua quá trình sản xuất102. Thuật toán SHAKE được sử dụng để hạn chế các liên kết chứa hydro103. Tất cả các hệ thống đều trải qua quá trình phân chia lại khối lượng hydro (HMR)104, phân phối lại khối lượng giữa các nguyên tử hydro và các nguyên tử nặng liên kết cộng hóa trị của chúng trong peptide. Điều chỉnh này cho phép tăng bước thời gian mô phỏng lên 4 fs.

Đối với hai hệ thống, mô phỏng ~ 20 μs thu được bằng cách áp dụng phương pháp lấy mẫu thích ứng105, được sử dụng để lấy mẫu hiệu quả không gian cấu trúc của peptide. Trong nghiên cứu này, lấy mẫu thích ứng dựa trên số lượng ít nhất đã được sử dụng để tìm ra các trạng thái cấu hình mới một cách nhanh chóng. Lấy mẫu thích ứng được thực hiện như sau: (1) Chạy một loạt MDS ngắn từ một tập hợp các cấu trúc ban đầu. (2) Tập hợp tất cả dữ liệu mô phỏng thu thập được bằng thuật toán K-means. Khoảng cách của tất cả các cặp dư lượng được ngăn cách bởi hai hoặc nhiều dư lượng được sử dụng làm tọa độ phản ứng để tạo ra 100 cụm. (3) Chọn ngẫu nhiên một tiểu bang từ mỗi cụm trong số 25 cụm có dân số ít nhất làm hạt giống để bắt đầu mô phỏng mới. (4) Lặp lại các bước 1-3 cho đến khi lấy mẫu đạt đến hội tụ.

Trong lấy mẫu thích ứng, một sự thiên vị được đưa ra khi các mô phỏng bắt đầu từ các tiểu bang ít dân nhất sau mỗi vòng, có khả năng dẫn đến sự phân bố dân số lệch khỏi quần thể cân bằng thực của các bang. Để loại bỏ sai lệch lấy mẫu này, một Mô hình trạng thái Markov (MSM) đã được xây dựng để kết nối tất cả các cụm bằng cách ước tính ma trận xác suất chuyển tiếp trên tất cả các trạng thái cấu trúc106,107,108.

Xây dựng Mô hình Nhà nước Markov (MSM)
MSM được xây dựng bởi gói python PyEMMA 2.5.6109. Khoảng cách của tất cả các cặp dư lượng được ngăn cách bởi hai hoặc nhiều dư lượng được sử dụng để mô tả dữ liệu mô phỏng và 136 khoảng cách dư lượng-dư lượng được đưa vào ma trận đặc trưng. Số lượng vi trạng thái tối ưu cho MSM được chọn bằng cách tối đa hóa điểm VAMP110. Thời gian trễ 20 ns được chọn từ biểu đồ thang thời gian ngụ ý và thử nghiệm Chapman-Kolmogorov111 được thực hiện để xác nhận hành vi Markovian của MSM.

Lý thuyết đường chuyển tiếp (TPT)
TPT được áp dụng để tính toán thang thời gian chuyển tiếp giữa các trạng thái cấu trúc khác nhau112. Thời gian chuyển tiếp từ trạng thái A sang trạng thái B được ước tính từ thời gian đi qua tự do trung bình (MFPT), là nghịch đảo của tốc độ phản ứng (1/({k}_{{AB}})) tính bằng phương trình sau (1):

$$1/{k}{{AB}}=\tau {\sum }{i=1}^{m}{\pi }{i}({1-q}{i}^{+})/F$$
trong đó τ là thời gian trễ của MSM, π_i là xác suất tĩnh của vi trạng thái i, F là tổng thông lượng giữa trạng thái A và trạng thái B, q_i^+ là xác suất cam chuyển tiếp mà khi hệ thống ở trạng thái vi mô i, nó sẽ đạt đến trạng thái B thay vì trạng thái A. TPT được thực hiện bởi gói python PyEMMA 2.5.6109.

Phân tích quỹ đạo
Mô-đun CPPTRAJ trong AMBER (Xây dựng mô hình được hỗ trợ với tinh chỉnh năng lượng) 2242 và gói python MDTraj113 được sử dụng để phân tích dữ liệu quỹ đạo và VMD 1.9.3114 và PyMol 2.1 (https://pymol.org/2/) được sử dụng để trực quan hóa ảnh chụp nhanh MDS. Gói Python Matplotlib115 được sử dụng để tạo biểu đồ 2-D của cảnh quan năng lượng tự do.

Định nghĩa về phân số liên hệ gốc
Tiếp xúc tự nhiên là tương tác giữa các dư lượng tiếp xúc trong cấu trúc bản địa116. Phần tiếp xúc bản địa, được ký hiệu là Q, được tính bằng phương trình sau (2):

$$Q\left(X\right)=\frac{1}{S}{\sum}{(i,\,j)\in S}\frac{1}{1+\exp [\beta ({r}{{ij}}\left(X\right)-\lambda {r}{{ij}}^{0})]}$$ trong đó X là một cấu hình, rij(X) là khoảng cách giữa nguyên tử i và j trong cấu hình (X), ({r}{{ij}}^{0}) là khoảng cách giữa các nguyên tử nặng i và j trong cấu hình gốc, S là tập hợp của tất cả các cặp nguyên tử nặng (i, j) thuộc dư θi và θj sao cho | θi – θj| >3 và ({r}_{{ij}}^{0}) < 4.5 Å, β = 5 Å−1 là tham số làm mịn, λ = 1.8 cho mô hình toàn nguyên tử.

Mô phỏng động lực học phân tử của tương tác corisin với albumin của người và bò
Thiết lập mô phỏng động lực học phân tử
Chúng tôi đã chuẩn bị hai hệ thống cho MDS: (i) HSA-corisin (Albumin-corisin huyết thanh người) và (ii) BSA-corisin (Albumin-corisin huyết thanh bò). Các cấu trúc phức tạp của HSA-corisin và BSA-corisin được dự đoán bởi AlphaFold-Multimer40. Các hệ thống được hòa tan trong hộp nước TIP3P và trung hòa bởi 150 mM NaCl. Trường lực hổ phách ff14SB được sử dụng để tham số hóa protein. Tất cả các hệ thống đều trải qua quá trình thu nhỏ và cân bằng trước bằng cách sử dụng phần mềm Amber 18117. Mỗi hệ thống MDS được thu nhỏ trong 5000 chu kỳ với thuật toán giảm dốc nhất và sau đó được giảm thiểu hơn nữa trong 45000 chu kỳ với thuật toán gradient liên hợp. Nhiệt độ của các hệ thống thu nhỏ được tăng từ 0 K lên 300 K theo tổng hợp NVT (Số lượng hạt, Thể tích, Nhiệt độ). Các bước làm nóng được thực hiện trong 3 ns bằng cách sử dụng bộ điều nhiệt Langevin với tần số va chạm là 2 ps-1. Các hệ thống sưởi ấm được điều áp đến áp suất không đổi 1 bar dưới quần thể NPT. Áp suất của các hệ thống được kiểm soát bằng cách sử dụng khí áp Monte Carlo. Trong các bước gia nhiệt và điều áp, các nguyên tử xương sống của protein được kiềm chế với trọng lượng 5 kcal / mol / Å2. Sau đó, các hạn chế được loại bỏ và các hệ thống được cân bằng thêm trong 50 ns trong một tập hợp NPT (300 K và 1 bar). Các quá trình sản xuất được thực hiện bằng cách sử dụng OpenMM41. Thuật toán lắc được sử dụng để hạn chế các liên kết chứa hydro103. Phân vùng lại khối lượng hydro (HMR) đã được áp dụng cho tất cả các hệ thống, phân phối lại khối lượng giữa các nguyên tử hydro và các nguyên tử nặng của protein / peptide để cho phép bước thời gian của mô phỏng được tăng lên 4 fs104.

Phân tích quỹ đạo
CPPTRAJ trong Amber 18 được sử dụng để xử lý quỹ đạo MDS42. Tính toán tính năng và phân tích dữ liệu được thực hiện bởi gói Python MDTraj113. VMD 1.9.3114 được sử dụng để hình dung quỹ đạo MDS.

Phân tích tương tác tuyến tính
Hàm Năng lượng tương tác tuyến tính (LIE)118 trong CPPTRAJ được sử dụng để ước tính các tương tác không liên kết giữa tất cả các nguyên tử trong phối tử và tất cả các nguyên tử trong môi trường xung quanh. 10 Å được sử dụng như một ngưỡng để xác định các nguyên tử xung quanh của phối tử. Năng lượng tự do liên kết được tính như một sự kết hợp tuyến tính của tĩnh điện và tương tác van der Waals cho các cặp nguyên tử dựa trên công thức sau (3) (giá trị mặc định: (\alpha=0,16,\,\beta=0,5,\,\gamma=0,0\,)):

$$\Delta {E}{{LIE}}=\alpha \left({E}{{bound}}^{{vdW}}-{E}{{free}}^{{vdW}}\right)+\beta \left({E}{{bound}}^{{ele}}-{E}_{{free}}^{{ele}}\right)+\gamma$$
Cảm ứng đợt cấp của xơ hóa thận ở chuột chuyển gen TGFβ1
Thí nghiệm này được tiến hành để điều tra xem liệu việc sử dụng corisin toàn thân có làm trầm trọng thêm tình trạng xơ hóa thận hay không. Những con chuột chuyển gen TGFβ1 cái (TG), 9 tuần tuổi, được chỉ định ngẫu nhiên vào hai nhóm điều trị. Một nhóm được tiêm corisin tổng hợp (n = 5) vào phúc mạc với liều 5 mg/kg trọng lượng cơ thể, tiêm ba lần mỗi tuần trong hai tuần. Một nhóm khác (n = 6) được sử dụng một peptide xáo trộn tổng hợp với liều lượng chính xác và thông qua cùng một con đường trong hai tuần. Trong một nghiên cứu trước đây, chúng tôi đã chứng minh rằng việc sử dụng corisin với liều 5 mg / kg hai ngày một lần trong hai tuần làm trầm trọng thêm sự tiến triển của xơ phổi. Dựa trên những phát hiện này, chúng tôi đã áp dụng một phác đồ liều lượng tương tự trong thí nghiệm hiện tại, sử dụng sáu liều trong hai tuần để đảm bảo tiếp xúc đầy đủ và bền vững với corisin đồng thời đánh giá tác dụng của nó đối với tình trạng xơ hóa thận trở nên tồi tệ hơn. Các mẫu huyết tương và nước tiểu được thu thập vào ngày 1, 8 và 15 từ cả hai nhóm để đánh giá chức năng thận. Vào ngày thứ 16, an tử đã được thực hiện, sau đó là việc thu thập máu, nước tiểu và mô thận cuối cùng.

Cảm ứng DM ở chuột TGFβ1 TG bị xơ hóa thận
DM được tạo ra ở chuột WT và TGFβ1 TG thông qua việc sử dụng streptozotocin (STZ) (Sigma, St. Louis, MO) trong phúc mạc với liều 40 mg / kg trọng lượng cơ thể trong năm ngày liên tiếp. Những con chuột nhận được một lượng nước muối sinh lý vô trùng (SAL) tương đương thông qua tiêm vào phúc mạc đóng vai trò là đối chứng. Lượng đường trong máu được đánh giá trong tuần thứ tư sau khi sử dụng STZ. DM đã được xác nhận thông qua xét nghiệm dung nạp glucose. Những con chuột có lượng đường trong máu vượt quá 200 mg / dL được phân loại là bệnh tiểu đường. Chuột TGFβ1 TG dành cho bệnh nhân tiểu đường và không mắc bệnh tiểu đường được an tử vào tuần thứ chín sau khi dùng STZ, và các mẫu máu, nước tiểu và mô thận được thu thập để phân tích thêm.

Cảm ứng bệnh thận tiểu đường ở chuột WT
Để đẩy nhanh sự khởi phát của bệnh thận liên quan đến DM, một nhóm chuột loại hoang dã đã trải qua phẫu thuật cắt bỏ thận một bên, sau đó là sử dụng STZ. Thủ thuật được thực hiện dưới gây mê sâu trong điều kiện vô trùng. Một vết rạch phẫu thuật được thực hiện dọc theo vùng lưng-thắt lưng bên phải, cho phép hình dung niệu quản và động mạch thận. Cả hai cấu trúc đều được thắt cẩn thận, và thận được cắt bỏ ở vùng gần gần hilum thận. Vết mổ sau đó được khâu và những con chuột được phép hồi phục trong bốn tuần. Sau khi hồi phục hoàn toàn, những con chuột được tiêm STZ vào phúc mạc với liều 40 mg / kg trọng lượng cơ thể trong năm ngày liên tiếp để gây ra DM. Những con chuột đối chứng được dùng một thể tích tương đương nước muối sinh lý vô trùng trong các điều kiện giống hệt nhau. Các mẫu máu được thu thập trong tuần thứ tư sau tiêm STZ để đo mức glucose. Những con chuột có lượng đường trong máu vượt quá 200 mg / dL được phân loại là bệnh nhân tiểu đường và được đưa vào nhóm nghiên cứu. Bốn tuần sau khi chẩn đoán DM, những con chuột được hiến tế một cách nhân đạo dưới gây mê sâu, và các mẫu mô máu và thận được thu thập để phân tích thêm. Để đánh giá mức độ xơ hóa ở mỗi nhóm chuột, nhuộm ba sắc của Masson được thực hiện trên các phần mô nhúng parafin, cố định formalin và mức độ xơ hóa được định lượng bằng phần mềm hình ảnh WinROOF.

Đánh giá hiệu quả điều trị của kháng corisin mAb trung hòa ở chuột TGFβ1 TG mắc bệnh xơ hóa thận
Thí nghiệm này nhằm mục đích điều tra tác dụng của điều trị kháng corisin ở chuột TGFβ1 TG mắc bệnh tiểu đường bị xơ hóa thận. Chuột TGFβ1 TG thường phát triển rối loạn chức năng thận sớm nhất là 8 tuần tuổi, so với các đối tác WTcủa chúng 31. Tuy nhiên, rối loạn chức năng thận này vẫn tương đối ổn định trong vài tuần trước khi tiến triển đến giai đoạn tử vong. Để giảm thiểu tỷ lệ tử vong sớm trong giai đoạn thử nghiệm, chuột TGFβ1 TG ở người bị rối loạn chức năng thận tương đối nhẹ đã được chọn để gây DM, cho phép quan sát đợt cấp của bệnh đồng thời giảm nguy cơ tử vong sớm. DM được tạo ra ở chuột TGFβ1 TG bằng cách tiêm streptozotocin (STZ) vào phúc mạc (Sigma, St. Louis, MO). STZ được sử dụng với liều lượng 40 mg / kg trọng lượng cơ thể trong năm ngày liên tiếp. Một nhóm đối chứng âm tính của chuột WT được dùng một lượng nước muối (SAL) tương đương trong phúc mạc. Cảm ứng DM được xác nhận bằng nồng độ đường huyết không lúc đói từ 200 mg / dL trở lên và bằng xét nghiệm dung nạp glucose trong phúc mạc. Sau khi cảm ứng DM, những con chuột được chỉ định vào ba nhóm: (1) chuột TGFβ1 TG được điều trị bằng anticorisin mAb (n = 5), (2) chuột TGFβ1 TG được điều trị bằng globulin miễn dịch đối chứng G (IgG) (n = 5) và (3) chuột loại hoang dã (WT) làm đối chứng âm tính (n = 4). Giai đoạn điều trị bắt đầu vào tuần thứ năm, khi chuột được tiêm thuốc kháng corisin mAtb hoặc IgG đối chứng vào phúc mạc với liều 10 mg / kg ba lần mỗi tuần trong tám tuần. Thời gian bán hủy được báo cáo của mAb kháng corisin là khoảng ba ngày. Để duy trì mức độ kháng thể ổn định, giảm thiểu các đáy đáng kể về nồng độ của nó và đánh giá hiệu quả của nó, chúng tôi đã tiêm ba liều mỗi tuần trong tám tuần29. Vào cuối giai đoạn thử nghiệm 13 tuần, những con chuột được hiến tế và các mẫu máu, nước tiểu và thận được thu thập để phân tích thêm nhằm đánh giá tác động của điều trị kháng corisin đối với xơ hóa thận.

Quy trình thu thập và xử lý mẫu bệnh phẩm
Những con vật được an tử bằng cách tiêm quá liều isoflurane 5% vào phúc mạc. Sau khi an tử, các mẫu được thu thập để phân tích sinh hóa và nhuộm mô học. Máu được lấy thông qua chọc dò tim kín ngực và được thu thập vào ống chứa 10 U / mL heparin như một chất chống đông. Các mẫu nước tiểu được thu thập bằng lồng trao đổi chất. Sau khi tuần hoàn toàn thân được rửa sạch bằng nước muối sinh lý, mỗi quả thận được bóc tách, cô lập và cân. Thận trái được bảo quản ở -80 °C để phân tích tiếp theo, trong khi thận phải được cố định trong 10% paraformaldehyde, khử nước, nhúng trong parafin và cắt thành các lát dày 3 μm để nhuộm bằng hematoxylin và eosin (H & E), axit tuần hoàn-Schiff (PAS) hoặc Masson’s trichrome. Hình ảnh của thận được cắt bỏ được chụp bằng kính hiển vi Olympus BX53 được trang bị máy ảnh kỹ thuật số (Olympus DP73, Tokyo, Nhật Bản). Xơ cứng cầu thận được đánh giá dựa trên nhuộm PAS. Đối với mỗi con chuột, 25 cầu thận được chọn ngẫu nhiên và chấm điểm như sau: 0 cho cầu thận bình thường, 1 cho dày mesangial nhẹ (vùng PAS dương tính <25%), 2 cho xơ cứng phân đoạn trung bình (vùng PAS dương tính 25–50%), 3 cho xơ cứng phân đoạn nặng (vùng PAS dương tính 50–75%), và 4 cho xơ cứng toàn cầu (vùng PAS dương tính ≥75%). Điểm trung bình từ 25 cầu thận được định nghĩa là điểm xơ cứng cầu thận. Sáu điều tra viên, mù quáng trước các nhóm điều trị, đã thực hiện tính điểm. Xơ hóa thận được đánh giá bằng cách sử dụng nhuộm ba màu của Masson. Mười hình ảnh vỏ thận trên mỗi con chuột được thu thập ngẫu nhiên và tỷ lệ diện tích dương tính ba sắc của Masson với tổng diện tích vỏ thận được tính bằng phần mềm xử lý hình ảnh WinROOF (Mitani Corp., Fukui, Nhật Bản).

Đánh giá tình trạng đái tháo đường và các thông số chức năng thận
Nồng độ glucose trong máu không lúc đói được theo dõi định kỳ để đánh giá tình trạng bệnh tiểu đường. Xét nghiệm dung nạp glucose được thực hiện bằng cách tiêm glucose vào phúc mạc với liều 1 g / kg sau khi nhịn ăn qua đêm, với lượng đường trong máu được đo ở 0, 15, 30, 60 và 120 phút. Nồng độ glucose trong máu được xác định bằng phương pháp glucose oxidase với bộ xét nghiệm glucose (Dojindo, Mashiki, Nhật Bản). Nồng độ albumin trong máu được đo bằng xét nghiệm A / G B (Wako, Osaka, Nhật Bản) và nồng độ albumin trong nước tiểu được đánh giá bằng Bộ ELISA nước tiểu chuột (Exocel, San Diego, Hoa Kỳ). Nồng độ creatinin trong máu được đo bằng Bộ Creatinine chuột (Crystal Chem, Elk Grove Village, Hoa Kỳ), nồng độ creatinin trong nước tiểu được xác định bằng Bộ đồng hành Creatinine (Exocel, San Diego, Hoa Kỳ) và nồng độ nitơ urê trong máu được đo bằng Bộ phát hiện nitơ urê (Arbor Assays, Ann Arbor, Hoa Kỳ).

Nhuộm hóa mô miễn dịch
Nhuộm corisin được thực hiện bằng cách sử dụng kháng thể đơn dòng chống corisin trong nhà (dòng A21; pha loãng 1:300) và các kháng thể có sẵn trên thị trường chống lại p21 (cat. số SC-6246; pha loãng 1:50; Công nghệ sinh học Santa Cruz, Dallas, TX, Hoa Kỳ), F4/80 (cat. số 28463-1-AP; pha loãng 1:1200; Proteintech, Rosemont, IL, Hoa Kỳ) và p53 (cat. số ab131442; pha loãng 1:400; Abcam, Cambridge, MA, Hoa Kỳ). Quy trình này được thực hiện tại MorphoTechnology Corporation ở Sapporo, Hokkaido, Nhật Bản, theo các quy trình tiêu chuẩn. Đánh giá hoạt động của SAβGal được thực hiện bằng X-Gal (Sigma-Aldrich) và bộ dụng cụ thương mại (Bộ phát hiện lão hóa tế bào Spider BGAL, Dojindo, Osaka, Nhật Bản). Kính hiển vi Olympus BX50 với máy ảnh kỹ thuật số OlympusDP70 (Tập đoàn Olympus, Tokyo, Nhật Bản) được sử dụng để thu thập dữ liệu. Phần mềm WinROOF2018 (Tập đoàn Mitani, Tokyo, Nhật Bản) được sử dụng để thu thập dữ liệu và chương trình NIH ImageJ1.54 m thuộc phạm vi công cộng được sử dụng để phân tích hình ảnh.

Phân tích sinh hóa
Nồng độ interleukin-1β (IL-1β), yếu tố tăng trưởng biến đổi-β1 (TGFβ1) (Hệ thống R & D, Minneapolis, MN), yếu tố hoại tử khối u-α (TNFα), protein thu hút hóa học đơn nhân-1 (MCP-1) (BD Bioscience, bộ dụng cụ BD OptEIA, San Diego, CA), yếu tố tăng trưởng mô liên kết (CTGF) (Abcepta, San Diego, CA), thrombin-antithrombin (TAT; Affinity Biologicals, Ontario, Canada) và D-dimer (Bioss Antibodies, Woburn, MA) được định lượng bằng cách sử dụng xét nghiệm miễn dịch liên kết enzyme (ELISA) có sẵn trên thị trường theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Mức độ collagen loại I được xác định bằng cách sử dụng ELISA sử dụng kháng thể chống collagen loại I và kháng thể chống collagen loại I liên hợp biotin từ Rockland Immunochemicals Inc. (Limerick, PA). Nồng độ creatinin được đo bằng phương pháp enzyme, trong khi nitơ urê trong máu được đánh giá thông qua phương pháp đo màu (Bộ hiệu chuẩn NIST NCal™; Arbor Assays, Ann Arbor, MI) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Protein liên kết axit béo loại gan (L-FABP) và phân tử tổn thương thận 1 (KIM-1) được định lượng bằng cách sử dụng bộ xét nghiệm miễn dịch enzyme thương mại (Hệ thống R & D). Nồng độ corisin được đo bằng cách sử dụng ELISA nội bộ như đã mô tả trước đây29. Tóm lại, một kháng thể chống transglycosylase 351 đa dòng được sử dụng để phủ một đĩa 96 giếng ở 2 μg / ml trong nước muối đệm phốt phát và ủ qua đêm ở 4 ° C. Sau khi ngăn chặn bằng albumin huyết thanh bò 1% trong nước muối đệm phốt phát và rửa kỹ lưỡng bằng nước muối đệm phốt phát có chứa Tween, các giếng được ủ với các nồng độ khác nhau của chất chuẩn corisin và mẫu huyết tương ở 4 ° C qua đêm. Các bước rửa tiếp theo được tiếp nối bằng việc bổ sung streptavidin liên hợp cải ngựa peroxidase (Hệ thống R & D). Sau khi rửa và ủ thêm, dung dịch chất nền được áp dụng để phát triển màu sắc và độ hấp thụ được đo ở độ cao 450 nm bằng đầu đọc vi tấm BIOD-RAD iMark™. Nồng độ corisin được tính toán từ một đường cong chuẩn, với cả sự thay đổi giữa và trong xét nghiệm được duy trì dưới 10%.

Xác định corisin liên kết với albumin và corisin tự do trong huyết thanh của bệnh nhân DM
Để đánh giá sự hiện diện của corisin tự do trong huyết thanh của bệnh nhân đái tháo đường (DM), 100 μL huyết thanh pha loãng gấp mười lần được áp dụng cho thiết bị siêu lọc Nanosep 10 K Omega (Pall Corporation, Port Washington, NY, Hoa Kỳ). Sau đó, mẫu được ly tâm theo hướng dẫn của nhà sản xuất để tách huyết thanh thành hai phần: một phần dòng chảy (<10 kDa) và một phần giữ lại (>10 kDa). Nồng độ corisin sau đó được định lượng bằng cách sử dụng xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (ELISA), như mô tả ở trên, trong phần giữ lại >10 kDa, phân đoạn dòng chảy <10 kDa và huyết thanh không phân đoạn, sau đại diện cho tổng nồng độ corisin trước khi lọc.

Khuếch đại các đoạn DNA mã hóa corisin/corisin-like peptide ở các đối tượng khỏe mạnh và bệnh nhân CKD tiểu đường
Một sự liên kết lớn của các trình tự polypeptide của các transglycosylase giống IsaA từ các vi khuẩn khác nhau đã được tạo ra để phát triển các mồi PCR khuếch đại đặc biệt DNA mã hóa các peptide proapoptotic trong mỗi mẫu nước tiểu. Hai trình tự bên cạnh các peptide proapoptotic (SVKAQF và WGTGSV) được bảo tồn cao, và việc sử dụng codon được bảo tồn trong các gen cho phép thiết kế hai mồi Corisin-F 5’ATCAGTTAAAGCTCAATTC và Corisin-R 5’GCTACTGAACCAGTACCCCATG, tương ứng là mồi tiến và ngược. Cặp mồi khuếch đại các đoạn DNA ~ 150 bp chứa trình tự mã hóa của các peptide proapoptotic. Các mồi đã được xác nhận bằng cách chiết xuất DNA bộ gen cộng đồng từ nước tiểu của các đối chứng khỏe mạnh (n = 4) và bệnh nhân mắc bệnh thận mạn do tiểu đường (n = 18). Đoạn có kích thước phù hợp được khuếch đại từ tất cả các DNA bộ gen được chiết xuất, ngoại trừ đối chứng âm tính (cùng hỗn hợp PCR, không có DNA) và các peptide giống corisin / corisin trong mẫu nước tiểu thu được bằng cách sử dụng giải trình tự DNA và phân tích tin sinh học được mô tả dưới đây.

Xây dựng và giải trình tự thư viện DNA Shotgun
Trong quá trình này, mỗi sản phẩm PCR được phân giải trong gel agarose và tinh chế (bộ lọc PCR QIAquick, Qiagen). Điều quan trọng là mỗi sản phẩm PCR được coi là thư viện thận và đường tiết niệu của một bệnh nhân CKD cụ thể hoặc đối chứng khỏe mạnh. DNA tiếp theo được sử dụng để chuẩn bị các thư viện duy nhất bằng cách sử dụng Bộ hỗn hợp chính chuẩn bị thư viện DNA NEBNext cho Illumina với Chỉ số kép duy nhất để ngăn chặn việc chuyển đổi chỉ số. Việc chuẩn bị thư viện được thực hiện bằng cách sử dụng bộ xử lý chất lỏng EpMotion 5075 (Eppendorf). Các thư viện mã vạch riêng lẻ được khuếch đại, định lượng bằng Qubit và phân giải trên Máy phân tích mảnh để xác nhận sự vắng mặt của mồi tự do và các dimer mồi và sự hiện diện của DNA có kích thước dự kiến. Các thư viện được gộp lại ở nồng độ cũng số và được định lượng thêm bằng qPCR trên Hệ thống thời gian thực BioRad CFX Connect (Bio-Rad Lab Inc., CA). Các thư viện súng ngắn có mã vạch được gộp lại được tải vào một flowcell MiSeq để giải trình tự (Illumina).

Phân tích tin sinh học
Các trình tự được xử lý bằng cách sử dụng quy trình làm việc dựa trên TADA Nextflow119.120, thực hiện các giao thức để khử nhiễu và giữ lại các biến thể trình tự khuếch đại độ phân giải đơn nucleotide (ASV)121 từ các trình tự khuếch đại đã biết và tùy chỉnh. ASV thu được được lập bảng và định lượng trên mỗi mẫu, được đánh giá cho các trình tự khảm tiềm năng và cuối cùng được so sánh với các trình tự tham chiếu đã biết bằng cách sử dụng BLASTN122. Căn chỉnh nhiều trình tự được thực hiện bằng cách sử dụng DECIPHER123, với các bản dịch protein cuối cùng được thực hiện trong R bằng cách sử dụng thư viện Bioconductor Biostrings124.

Phân tích biểu hiện gen
RNA được phân lập từ tế bào hoặc mô thận bằng thuốc thử Sepasol RNA-I Super G từ Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Nhật Bản. DNA bổ sung (cDNA) được tổng hợp từ 2 μg tổng RNA với mồi oligo-dT và ReverTra Ace Reverse Transcriptase (Khoa Khoa học Đời sống Toyobo, Osaka, Nhật Bản). PCR tiêu chuẩn sau đó được tiến hành bằng cách sử dụng các mồi được liệt kê trong Bảng bổ sung 3. Tùy thuộc vào gen đích, PCR được thực hiện trong 26 đến 35 chu kỳ, với biến tính ở 94 ° C trong 30 giây, ủ ở 65 ° C trong 30 giây và kéo dài ở 72 ° C trong 1 phút, sau đó là mở rộng cuối cùng ở 72 ° C trong 5 phút. Mức độ biểu hiện mRNA được chuẩn hóa thành biểu hiện mRNA glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH).

Phân tích giải trình tự RNA đơn bào
Nuôi cấy và xử lý tế bào
Tế bào biểu mô ống gần thận người (RPTEC) được lấy từ LONZA (Houston, TX) và nuôi cấy trong môi trường tăng trưởng tế bào biểu mô thận (LONZA) trong điều kiện tiêu chuẩn (37 °C, 5% CO₂). Ở độ hòa hợp 70%, môi trường nuôi cấy được thay thế bằng môi trường tươi có chứa 20 μg / mL corisin (được điều chế dưới dạng dung dịch gốc ở mức 2 mg / mL trong albumin người tái tổ hợp 0,5%) hoặc 20 μg / mL peptide trộn trong albumin người tái tổ hợp 0,5%. Các tế bào được ủ trong các điều kiện này trong 24 giờ. Sau khi xử lý, các tế bào được thu hoạch bằng cách sử dụng trypsin hóa, rửa trong PBS lạnh, ép viên bằng cách ly tâm (300 g, 5 phút, 4 °C) và bảo quản lạnh trong môi trường đông lạnh có chứa BAMBANKER (GC LYMPHOTEC Inc., Tokyo, Nhật Bản). Các tế bào đông lạnh được lưu trữ trong nitơ lỏng cho đến khi xử lý thêm. Giải trình tự RNA đơn bào được thực hiện bởi Takara Bio Inc. (Shiga, Nhật Bản) (https://www.takarabio.com/). Khả năng tồn tại của tế bào được đánh giá trước khi chuẩn bị thư viện bằng cách sử dụng Máy đếm tế bào tự động Countess II (Thermo Fisher Scientific), đảm bảo khả năng tồn tại >80%. Khoảng 10.000 tế bào trên mỗi mẫu được nạp vào Bộ điều khiển Chromium (10x Genomics) để đóng gói giọt. Thư viện cDNA được chuẩn bị bằng cách sử dụng Bộ chuẩn bị mẫu RNA cố định tế bào đơn Chromium Next GEM, Bộ tế bào đơn Chromium Next GEM Chip Q và Bộ chỉ mục kép TS Set A (10x Genomics) theo các giao thức của nhà sản xuất. Giải trình tự được thực hiện bằng cách sử dụng hệ thống Novaseq X Plus (Illumina) để đạt được độ sâu giải trình tự mục tiêu là 50.000–100.000 lần đọc trên mỗi tế bào.

Tiền xử lý dữ liệu và kiểm soát chất lượng
Dữ liệu giải trình tự thô đã được giải phóng, căn chỉnh và định lượng thành số lượng được lọc UMI bằng cách sử dụng Cell Ranger (v.4.0.0; 10x Genomics) chống lại bộ gen tham chiếu hg38 (refdata-gcs-GRCh38-2020-A). Kiểm soát chất lượng đã được thực hiện để loại trừ các tế bào và hiện vật chất lượng thấp: các tế bào có ít hơn 200 gen được phát hiện, ít hơn 500 UMI hoặc biểu hiện gen ty thể lớn hơn 10% đã bị loại trừ. Sau khi lọc, 9327 tế bào từ các mẫu được xử lý bằng corisin và 8.186 tế bào từ các mẫu được xử lý bằng peptide đã được giữ lại để phân tích hạ lưu.

Chuẩn hóa dữ liệu, phân cụm và trực quan hóa
Dữ liệu biểu hiện gen được chuẩn hóa được tạo bằng phương pháp LogNormalize trong gói Seurat R (v.4.0.0), chia tỷ lệ biểu hiện của từng gen bằng tổng số lượng UMI và nhân với hệ số tỷ lệ 10.000. Dữ liệu được mở rộng thêm bằng cách sử dụng hàm ScaleData và các gen có thể thay đổi cao được xác định để giảm kích thước. Phân cụm được thực hiện bằng thuật toán Louvain được thực hiện trong hàm FindClusters với tham số độ phân giải được đặt thành 0.3. Xấp xỉ và chiếu đa tạp đồng nhất (UMAP) được sử dụng để giảm kích thước và trực quan hóa với hàm Seurat RunUMAP sử dụng các tham số mặc định.

Quỹ đạo và phân tích biểu hiện gen khác biệt
Phân tích quỹ đạo được thực hiện bằng cách sử dụng Monocle2 (v.2.20.0), với ma trận biểu hiện gen đầu vào được xử lý thông qua các bước ước tính yếu tố kích thước và độ phân tán. Các tế bào được sắp xếp theo thời gian giả dựa trên các gen thay đổi nhất, như được xác định bởi phương pháp “dpFeature” trong Monocle2. Các gen biểu hiện khác nhau (DEG) được xác định bằng cách sử dụng chức năng Seurat FindMarkers với thử nghiệm tổng xếp hạng Wilcoxon. DEG được xác định bằng sự thay đổi gấp đôi >2 và giá trị P < 0,05.

Phân tích lộ trình và mạng lưới
Phân tích làm giàu con đường được thực hiện bằng cách sử dụng Enrichr (https://maayanlab.cloud/Enrichr/) với các thư viện KEGG và Reactome. Các con đường có tỷ lệ phát hiện sai (FDR) <0,05 được coi là đáng kể. Các gen được điều chỉnh cao trong các tế bào được xử lý bằng corisin đã được phân tích tương tác protein-protein (PPI) bằng cách sử dụng cơ sở dữ liệu STRING (v.11.5; https://string-db.org/) với điểm tin cậy tương tác tối thiểu là 0,7. Các mạng PPI kết quả được trực quan hóa và phân tích bằng cách sử dụng Cytoscape (v.3.9.1).

Phân tích thống kê
Dữ liệu có phân phối chuẩn được trình bày dưới dạng giá trị trungbình ± độ lệch chuẩn (SD) hoặc sai số chuẩn của giá trị trung bình (SEM), trong khi dữ liệu sai lệch được biểu thị dưới dạng trung vị (phạm vi liên tứ vị). Phân phối dữ liệu được đánh giá bằng cách sử dụng thử nghiệm Shapiro-Wilk hoặc Kolmogorov-Smirnov. Sự khác biệt thống kê giữa hai biến phân phối bình thường được đánh giá bằng cách sử dụng thử nghiệm t của Học sinh không ghép đôi hai mặt, trong khi sự khác biệt giữa ba biến phân phối bình thường trở lên được phân tích bằng cách sử dụng phân tích phương sai một chiều (ANOVA), sau đó là thử nghiệm sau Newman-Keuls. Đối với dữ liệu bị lệch, thử nghiệm Mann-Whitney U hai mặt được áp dụng để so sánh giữa hai nhóm, trong khi ANOVA Kruskal-Wallis theo sau là thử nghiệm sau của Dunn được sử dụng để so sánh nhiều nhóm. Mối liên hệ giữa eGFR và các biến khác được đánh giá bằng cách sử dụng phân tích hồi quy tuyến tính đơn biến và đa biến. Các biến có p < 0,05 trong phân tích đơn biến được đưa vào mô hình đa biến. Hệ số tương quan xếp hạng của Spearman phi tham số được sử dụng để đánh giá mối tương quan giữa corisin và các biến khác. Hiệu chỉnh cho nhiều so sánh đã được áp dụng khi thích hợp. Giá trị P nhỏ hơn 0,05 được coi là có ý nghĩa thống kê. Các phân tích thống kê được thực hiện bằng cách sử dụng GraphPad Prism phiên bản 10.5 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA).

Tóm tắt báo cáo
Thông tin thêm về thiết kế nghiên cứu có sẵn trong Tóm tắt Báo cáo Danh mục đầu tư của Nature được liên kết với bài viết này.